钙调蛋白激酶MsCIPK4通过增强ROS清除能力赋予紫花苜蓿耐旱耐盐性的分子机制

本研究针对土壤盐碱化和荒漠化对紫花苜蓿(Medicago sativa)生产的威胁，通过克隆钙调蛋白激酶基因MsCIPK4，揭示其与MsCBLs蛋白互作形成CBL-CIPK信号模块，通过激活SOD/POD/CAT抗氧化酶系统及上调ATPase/P5CS等胁迫相关基因表达，显著提升转基因拟南芥和苜蓿的耐盐性与耐旱性，为牧草分子育种提供新靶点。

　　

（背景段）
全球土壤盐碱化和荒漠化正严重威胁农业生产，其中被誉为"牧草之王"的紫花苜蓿(Medicago sativa)对盐旱胁迫尤为敏感。当遭遇200 mM NaCl或20% PEG模拟的干旱胁迫时，苜蓿叶片会迅速积累超氧阴离子(O^2-)，导致膜脂过氧化产物丙二醛(MDA)含量激增。虽然植物已进化出钙离子(Ca²⁺)介导的应激响应机制，但作为关键信号组分的钙调磷酸酶B样蛋白互作激酶(CIPK)在苜蓿中的功能仍属空白。

（研究机构与成果）
中国农业科学院的研究团队在《Plant Science》发表的研究中，从紫花苜蓿中克隆获得MsCIPK4基因。该基因编码的蛋白具有典型NAF和PPI结构域，能与MsCBL2/6/7/10在内质网膜形成复合物。通过农杆菌介导的遗传转化技术，研究人员构建了过表达MsCIPK4的拟南芥和苜蓿株系。在200 mM NaCl处理下，转基因苜蓿的SOD活性提升5倍，MDA含量降低40%；20% PEG胁迫时，过表达株系的种子萌发率比野生型提高20%。

（关键技术）
研究采用Gateway克隆技术构建表达载体，通过农杆菌GV3101介导的叶盘法获得转基因植株。利用酵母双杂交验证蛋白互作，激光共聚焦定位显示MsCIPK4-GFP定位于内质网。qRT-PCR检测显示胁迫相关基因V-ATPase在根中表达量提升67倍。生理指标检测使用Solarbio试剂盒测定SOD/POD/CAT活性。

（研究结果）
3.1 序列特征分析
MsCIPK4编码410个氨基酸，理论等电点8.86，二级结构中α-螺旋占34.66%。系统进化分析显示其与可可TcCIPK7亲缘最近。

3.2 组织特异性表达
qRT-PCR显示该基因在根中表达量是花的10⁴倍，暗示其根系特异性功能。

3.3 亚细胞定位
烟草瞬时表达证实MsCIPK4-GFP与内质网标记蛋白mCherry共定位。

3.4 蛋白互作验证
酵母双杂交显示MsCIPK4与MsCBL2结合力最强，激活报告基因使菌落显蓝色。

3.5 拟南芥表型分析
转基因株系在盐胁迫下根长增加8倍，脯氨酸合成酶基因P5CS表达上调14倍。

3.7 苜蓿生理响应
20% PEG处理24小时后，OE株系CAT活性达野生型2.3倍，NBT染色显示O^2-积累减少。

（结论与意义）
该研究首次阐明MsCIPK4-MsCBL2模块通过"钙信号-抗氧化酶-胁迫基因"三级调控网络增强苜蓿抗逆性。其中内质网定位的CIPK4能同时响应盐旱胁迫，通过激活HAK5钾转运蛋白和COR47冷调节蛋白的表达，将苜蓿的胁迫耐受阈值提高200%。这一发现为培育耐盐碱牧草品种提供了分子标记，对保障干旱区畜牧业发展具有重要应用价值。