长读长测序技术揭示疟原虫GCH1基因拷贝数变异与精确扩增机制

本研究通过牛津纳米孔长读长测序技术（ONT），首次在恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）中实现了GCH1基因拷贝数变异（CNV）的单分子可视化。研究人员发现DHODH抑制剂（DSM1）耐药株存在GCH1基因的阶梯式双单元扩增（最高达9个拷贝），揭示了AT富集序列驱动的精确扩增机制。该研究为理解抗疟药物耐药性进化提供了新视角，发表于《BMC Genomics》。

　　

疟疾作为威胁人类健康的重大传染病，其治疗长期受困于疟原虫快速进化的耐药性。传统短读长测序技术难以解析恶性疟原虫AT富集基因组中的复杂结构变异，特别是与抗药性相关的基因拷贝数变异（CNV）。近期研究发现，嘧啶合成通路关键酶二氢乳清酸脱氢酶（DHODH）的扩增可导致DSM1抑制剂耐药，但叶酸合成通路起始酶GTP环化水解酶I（GCH1）的拷贝数变化与耐药性的关联机制尚不明确。

美国弗吉尼亚大学（University of Virginia）的研究团队创新性地采用牛津纳米孔长读长测序技术（ONT），对DSM1耐药株的GCH1基因座进行单分子解析。通过开发定制化可视化工具，实现了5kb级串联重复结构的直接观测，发现耐药株存在3-9个GCH1拷贝的群体异质性，且扩增以精确的双单元阶梯模式进行。研究同时证实AT富集序列是扩增边界形成的分子触发器，并首次提出GCH1预扩增可能促进DHODH基因座扩增的代谢偶联假说。

关键技术方法包括：①基于ONT平台的超长读长（N50达99.7kb）全基因组测序；②自主研发的R Shiny单分子可视化分析工具；③液滴数字PCR（ddPCR）验证拷贝数；④k-mer频率分析工具GeneToCN定量扩增水平；⑤使用Dd2、3D7等实验室疟原虫株构建DSM1耐药模型。

【研究结果】
直接长读长可视化揭示GCH1拷贝数隐藏变异
通过分析>10kb的ONT单分子读长，发现DSM1耐药株H2中存在7-9个GCH1拷贝的稀有变异体（占群体50%），而亲本株WT1严格维持3拷贝。值得注意的是，短读长测序和qPCR均低估了这种异质性，凸显长读长技术在解析微进化事件中的优势。

GCH1扩增单元结构与边界特征
所有扩增体均保持3基因单元结构（GCH1-RPL24-YHM2），但耐药株出现头对尾倒置的双单元重复模式。边界分析发现AT二核苷酸（触发DNA断裂）和同聚A/T序列（介导错误修复）的保守存在，符合疟原虫CNV形成的"触发位点"模型。

DHODH与GCH1拷贝数的代谢关联
GeneToCN分析显示两基因拷贝数显著正相关（R²=0.9985）。历史数据分析表明，含天然GCH1扩增的Dd2/3D7株更易获得DHODH扩增型耐药，而GCH1单拷贝的HB3株则耐药诱导失败，提示叶酸-嘧啶代谢网络的协同进化。

【结论与意义】
该研究通过创新性的单分子可视化策略，揭示了疟原药耐药进化中未被认识的基因组异质性。阶梯式扩增机制和代谢通路偶联的发现，为理解病原体适应性进化提供了新范式。技术上建立的ONT分析方法，为AT富集基因组的结构变异研究树立了标杆。从转化医学角度看，GCH1作为"耐药性放大器"的发现，为抗疟联合用药策略设计提供了新靶点。研究还暗示临床分离株的GCH1背景筛查可能预测DHODH抑制剂疗效，这对遏制东南亚地区新兴耐药株传播具有重要预警价值。