利用长读长测序技术解析全长蛋白质相互作用网络：AVA-Seq方法的创新应用

本研究针对蛋白质相互作用检测技术的局限性，开发了基于牛津纳米孔长读长测序的AVA-Seq新方法。研究人员通过合成生物学技术构建全长人类基因文库，结合单分子测序平台，成功鉴定出159个蛋白质相互作用对（包括15个已知互作），验证了该方法在保留全长蛋白结构信息的同时实现高通量检测的能力。该技术为蛋白质互作研究提供了低成本、高灵敏度的创新解决方案。

　　

在生命科学研究中，解析蛋白质相互作用网络（Protein-Protein Interaction, PPI）是理解细胞功能机制的关键。然而传统双杂交技术存在通量低、成本高、片段化检测等局限，特别是难以在保留全长蛋白结构的情况下实现大规模互作筛选。随着人类相互作用组预测规模的不断扩大，开发新型检测技术成为当务之急。来自威尔康奈尔医学院卡塔尔分校（Weill Cornell Medicine in Qatar）的研究团队在《Scientific Reports》发表创新成果，将合成DNA技术与牛津纳米孔测序（Oxford Nanopore Technologies, ONT）相结合，建立了可检测全长蛋白互作的AVA-Seq方法。

研究团队采用三项关键技术：1）合成生物学构建57个人类全长基因文库（1.8kbp以内），通过特殊适配体实现定向克隆；2）创新性单质粒载体pAVA设计，将传统双杂交系统的DNA结合域（DBD）和激活域（AD）整合到同一载体；3）利用MinION平台进行长读长测序，通过生物信息学分析log₂FC值鉴定互作对。实验设置0mM、2mM和5mM 3-AT（3-氨基-1,2,4-三唑）三种选择压力，通过9小时液体培养实现高效筛选。

【结果部分】
"Individually tested full-length pairs in pAVA"证实pAVA载体可支持全长蛋白互作检测，关键互作对如PSMD4|RAD23A在5mM 3-AT条件下仍显示活性。"High-throughput AVA-Seq project design"展示创新性的实验设计：将基因按长度分为<1299bp和≥1300bp两组，避免测序偏好性。"Coverage of interaction space"显示成功覆盖97.6%的测试组合（3,115/3,192），其中159个互作通过严格标准验证。"Identification of auto activators"建立"粘性蛋白"（如LMNA、LMNB1）的识别标准，避免假阳性。"Known and novel interactions recovered"确认28.6%的金标准互作检出率（8/28），与常规双杂交技术相当。

讨论部分指出，AVA-Seq的创新性体现在：1）单质粒设计克服传统双杂交的多质粒共转化效率限制；2）长读长测序实现全长蛋白互作检测，保留天然构象信息；3）读数定量（log₂FC）比菌落计数更灵敏。研究还发现某些互作（如PPP3CA|PPP3R1）能被AVA-Seq检出而其他方法遗漏，提示该方法可捕获独特互作群体。尽管存在"粘性蛋白"干扰等技术挑战，该方法为中小型实验室开展互作研究提供了新选择，特别适用于课程导向的本科生研究项目（CUREs）。这项研究首次将ONT平台应用于蛋白质互作检测，为相互作用组学研究开辟了新途径。