日本脑炎病毒衣壳蛋白非组装依赖性分泌机制及其在病毒传播中的多重作用

日本脑炎病毒(JEV)衣壳蛋白(C)在病毒粒子组装外是否存在其他功能尚不明确。研究人员通过构建HiBiT标签融合的重组JEV病毒(JEV C-HiBiT)，首次系统揭示了感染细胞中衣壳蛋白通过溶酶体分泌途径以游离态、囊泡包裹态等多种形式释放，并证实其可能参与病毒传播调控。该研究为理解黄病毒属病毒衣壳蛋白的多重功能提供了新视角。

　　

日本脑炎病毒(JEV)作为黄病毒属(Orthoflavivirus)的重要成员，每年导致全球约6.8万例脑炎病例，其衣壳蛋白(C)长期以来被认为仅参与基因组包装和病毒粒子组装。然而，越来越多的证据表明，这类高度保守的12 kDa蛋白可能具有更复杂的生物学功能——从调控宿主细胞核仁功能到参与脂滴(LDs)代谢，但其在病毒生命周期中的确切作用机制仍存在巨大知识空白。尤其令人困惑的是，先前研究在瞬时表达系统中观察到衣壳蛋白的独立分泌现象，这是否真实存在于病毒感染过程？这些游离的衣壳蛋白究竟通过何种途径释放？它们是否在病毒传播中扮演特殊角色？这些问题直接关系到对黄病毒致病机制的全面理解。

为解决这些关键问题，日本大阪大学(Osaka University)的研究团队创新性地利用循环聚合酶延伸反应(CPER)技术，成功构建了携带HiBiT标签的重组JEV病毒株(JEV C-HiBiT)。HiBiT作为仅11个氨基酸的超敏感报告标签，能与LgBiT蛋白结合形成活性纳米荧光素酶(NanoLuc)，使研究者能够精确追踪极微量的衣壳蛋白动态。通过蔗糖密度梯度(SDG)离心联合纳米荧光检测技术，团队系统分析了293T、SH-SY5Y等多种宿主细胞分泌的衣壳蛋白形态；运用溶酶体抑制剂Bafilomycin A1处理、免疫荧光共定位等实验揭示了非经典分泌途径的作用机制。

主要技术方法
研究采用循环聚合酶延伸反应(CPER)构建重组病毒，通过HiBiT/LgBiT生物发光系统检测衣壳蛋白分泌动态，结合蔗糖密度梯度离心分离不同形态的分泌组分，并运用溶酶体抑制剂处理、透射电镜(TEM)和共聚焦显微镜分析细胞内运输途径。

研究结果
Abstract
研究发现JEV C-HiBiT保持与野生型病毒相当的复制能力，但感染细胞表现出强烈的HiBiT依赖性发光活性。SDG分析揭示衣壳蛋白以两种主要形态释放：对应病毒粒子的重峰和游离蛋白的轻峰。在神经母细胞瘤SH-SY5Y等细胞中还检测到亚病毒颗粒(SVP)和膜囊泡相关的中间态。

Introduction
系统回顾了黄病毒衣壳蛋白在基因组包装中的经典作用，指出其碱性表面(核酸结合)和疏水表面(膜相互作用)的双重特性，并强调核仁定位等非常规现象可能暗示未知功能。

Cells and reagents
实验涵盖Vero、Huh7等六种细胞系，证实不同宿主细胞对衣壳蛋白分泌形态的调控差异，其中C6/36蚊细胞显示出独特的分泌谱。

Construction of recombinant JEV
CPER技术成功克服JEV克隆不稳定性问题，C端HiBiT标签插入未影响NS2B-3蛋白酶对衣壳蛋白的加工效率，为后续研究奠定基础。

Discussion
首次证实病毒感染中存在四种衣壳蛋白分泌形态：①裸露游离态 ②囊泡包裹态 ③SVP结合态 ④病毒粒子整合态。溶酶体抑制剂实验表明约50%的游离蛋白通过溶酶体分泌途径释放，免疫荧光显示衣壳蛋白与LAMP1⁺溶酶体共定位。特别值得注意的是，在神经元样SH-SY5Y细胞中检测到富含衣壳蛋白的外泌体样囊泡，暗示其在神经侵袭过程中的潜在作用。

这项研究从根本上改变了对黄病毒衣壳蛋白功能的传统认知，证明其不仅是病毒组装的"结构砖块"，更可能是通过非经典分泌途径参与细胞间通讯的多功能蛋白。发现的不同分泌形态可能对应着免疫逃逸、神经侵袭等不同病理过程，为开发针对衣壳蛋白分泌环节的新型抗病毒策略提供了理论依据。论文中建立的HiBiT标记技术平台，也为其他病毒蛋白的微量动态研究提供了范式。