CpAgo蛋白的PAZ口袋与二聚化驱动其非依赖向导的DNA引导双催化机制解析

本研究针对原核Argonaute蛋白(pAgos)在细菌防御中的机制未明问题，聚焦嗜温性CpAgo蛋白的催化特性。研究人员通过冷冻电镜技术揭示了PAZ结构域中新型核苷酸结合口袋的关键作用，发现二聚化是催化活性的必要条件，证实CpAgo能通过向导依赖/非依赖双路径降解外源核酸。该研究为原核免疫机制提供了结构基础，并为基因编辑工具开发开辟新思路。

　　

在生命科学的微观战场上，原核生物与入侵核酸的博弈从未停歇。Argonaute蛋白家族作为这场攻防战的核心"武器"，其真核成员(eAgos)通过RNA干扰机制已广为人知，但原核版本(pAgos)的作战方式仍笼罩着神秘面纱。特别是嗜温性pAgos在37°C下的防御机制，因缺乏高分辨率结构证据而争议不断。更令人困惑的是，这些蛋白既能不依赖向导链(gDNA)直接降解核酸，又能利用降解产物作为新向导实施精准打击——这种"双模式"切换的分子密码亟待破解。

中国科学技术大学的研究团队选择产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的CpAgo作为突破口，这项发表于《Nature Communications》的研究首次绘制了嗜温性pAgo的三维作战蓝图。通过冷冻电镜技术捕获了CpAgo与DNA复合物的8种状态，结合功能实验揭示了其独特的PAZ口袋与二聚化激活机制，为理解原核生物的核酸防御系统提供了范式转变级的认知。

研究团队运用冷冻电镜单颗粒分析技术解析了2.86-3.81 ?分辨率的多组结构，采用位点特异性突变验证功能域，通过体外核酸降解实验和细菌内干扰实验证实活性。关键实验技术包括：1)设计气泡DNA支架模拟部分解旋dsDNA状态；2)SEC分离单体/二聚体复合物；3)PAZ口袋静电势分析指导突变体设计；4)大肠杆菌双质粒干扰系统量化体内活性。

结果部分的核心发现：

Guide-independent catalysis and substrate versatility of CpAgo
实验证实CpAgo无需向导链即可高效降解质粒和SL5 RNA，产生约21nt的DNA片段。截断实验表明N-PAZ结构域足以维持降解活性，且D80/D249构成非经典催化中心。Mn²⁺显著增强活性而Zn²⁺抑制，暗示金属离子依赖性不同于PIWI结构域的DEDX催化四联体。

Previously uncharacterized PAZ nucleotide-binding pocket
冷冻电镜发现PAZ结构域存在带正电荷的核苷酸结合口袋，突变其关键残基(K50/R246等)不仅破坏dsDNA切割，还使底物偏好性从DNA转向RNA。D80A/D249A突变显著削弱非依赖向导的降解能力，揭示该口袋兼具底物识别与催化双重功能。

Verification using bubble DNA scaffold
设计的58-mer气泡DNA证实tg_dsDNA-F链可缠绕于CpAgo表面并插入PAZ口袋。这一发现解释了CpAgo处理部分解旋dsDNA的独特能力，为理解其与DNA复制/转录过程的协同提供结构基础。

Dimeric CpAgo as the functional state
结构分析显示二聚化通过N-PAZ、PIWI-PIWI和MID-PIWI三个界面稳定，催化残基D544在二聚体中被精确锚定至切割位点(t10'-t11')。单体向二聚体转变时，引导-靶标双链末端发生90°扭转，形成与Tyr37/Lys42等残基的特异互作，这些互作的破坏导致切割效率丧失。

Functional validation in bacterial Cells
体内实验显示野生型CpAgo能显著清除质粒，而PAZ口袋突变体(D80A/D249A)该活性减弱。双质粒干扰系统证实向导DNA对靶向切割的必要性，验证了"降解-引导-再切割"的级联防御模型。

这项研究建立了CpAgo的双模式防御范式：一方面通过PAZ口袋非特异降解入侵核酸，产生的siDNA片段作为新向导；另一方面通过二聚化激活实现序列特异性切割。该机制不仅解释了嗜温菌在37°C下的高效免疫策略，其PAZ口袋的发现更突破了人们对Argonaute蛋白催化中心的传统认知。

从应用视角看，CpAgo的独特性质带来三重突破：1)PAZ口袋的底物可塑性为设计新型核酸酶提供工程靶点；2)二聚化依赖的激活机制启发了变构调控工具开发；3)37°C下的稳定活性填补了常温基因编辑工具空白。正如审稿人所言，这项工作"重新绘制了原核Argonaute的功能图谱"，为合成生物学和基因治疗领域提供了极具价值的分子蓝图。