链霉菌异源表达硫肽抗生素GE2270A的工程化探索：一个警示性案例研究

本研究针对硫肽抗生素GE2270A在天然生产者Planobispora rosea中遗传操作困难的问题，通过数据驱动的理性工程策略在模式菌株Streptomyces coelicolor M1146中重构生物合成基因簇(BGC)。虽然通过增加关键基因拷贝数使产量显著提高3倍，但最高产量(4.8±1.6 mg/L)仍远低于天然生产者(12倍)和替代宿主Nonomuraea ATCC 39727(50倍)。多组学分析揭示了PbtX蛋白在生物合成中的潜在重要作用，为硫肽类抗生素的异源表达提供了重要参考案例。

　　

在抗生素研发领域，硫肽类化合物因其独特的结构和作用机制备受关注。GE2270A作为一种临床相关硫肽抗生素，通过特异性结合细菌延伸因子Tu(EF-Tu)发挥抗菌作用，其衍生物LFF-571和CB-06-01已进入临床研究阶段。然而，其天然生产者Planobispora rosea存在遗传操作困难的技术瓶颈，严重制约了该药物的产量提升和结构改造研究。

英国利物浦大学系统与分子生物学研究所的研究团队在《Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology》发表了一项警示性研究。他们选择遗传操作体系成熟的Streptomyces coelicolor M1146作为宿主，通过多组学指导的理性工程策略对GE2270A生物合成途径进行系统优化。研究首先通过适应性进化获得了耐受200 mg/L GE2270A的工程菌株LW200，随后采用基因剂量效应策略，增加前体肽基因pbtA、调控基因pbtR以及假想蛋白基因pbtX的拷贝数。通过HPLC定量分析、比较转录组学和蛋白质组学等技术手段，全面评估了不同工程菌株的生产性能。

关键技术方法包括：1) 通过连续传代培养筛选获得GE2270A高耐受菌株；2) 采用CRISPR-Cas9系统进行基因组编辑；3) 利用LC-MS/MS进行代谢组学分析；4) 通过RNA-seq技术比较天然生产者与异源宿主的基因表达差异；5) 应用AlphaPullDown预测蛋白互作网络。

【结果部分】

【Generation of an M1146-derivative with improved resistance to GE2270A】
研究通过适应性进化获得耐受200 mg/L GE2270A的工程菌株LW200，相比亲本菌株(仅耐受1.25 mg/L)提高了160倍。值得注意的是，直接替换tuf1基因虽可提高耐受性，但导致严重生长缺陷。

【Increasing the copy number of the cluster-associated regulator improves GE2270A production】
引入额外pbtR拷贝使产量从1.42±0.25 mg/L提升至3.44±1.07 mg/L。蛋白质组数据显示PbtX是表达量最高的簇相关蛋白，暗示其可能发挥重要作用。

【Comparing gene expression and protein levels of the GE2270-related genes between natural producer and the heterologous host】
转录组比较发现天然生产者中pbtX-pbtM1-pbtM2操纵子表达显著高于其他簇基因。AlphaPullDown预测显示PbtX可能与修饰酶PbtF存在相互作用。

【Cluster refactoring by introducing constitutive promoters and generation of a minimal cluster also yield no GE2270A】
采用组成型启动子重构基因簇导致产量完全丧失，表明天然操纵子结构对功能途径组装至关重要。最小化簇构建同样未能产生目标化合物。

【Nonomuraea as alternative expression host】
对比实验证实Nonomuraea ATCC 39727的产量优势(250 mg/L)，其代谢谱显示更丰富的中间体多样性，是研究生物合成机制的理想平台。

【结论与意义】
这项研究揭示了宿主选择对天然产物异源表达的决定性影响。虽然S. coelicolor在遗传操作便利性上具有优势，但其对GE2270A的固有敏感性和代谢网络限制导致产量难以突破。多组学分析首次系统比较了天然与异源生产系统的分子特征，发现PbtX可能是生物合成的关键调控节点。研究为复杂硫肽抗生素的合成生物学研究提供了重要案例，强调在代谢工程中需要平衡遗传操作便利性与宿主适配性的关系。特别值得注意的是，即使采用最先进的理性设计策略，某些天然产物的高效生产仍高度依赖特定宿主的内源性代谢网络，这一发现对合成生物学研究具有普遍指导意义。