利用电子显微镜与ToxTracker体外检测技术解析工业相关纳米材料的细胞摄取潜能及遗传毒性机制

纳米材料(NMs)的遗传毒性评估面临传统方法无法解决的独特挑战。本研究通过透射电镜(TEM)结合ToxTracker报告基因系统，分析了10种工业相关纳米材料在胚胎干细胞(mES)中的摄取行为与遗传毒性终点，发现TiO2-NM105、二氧化硅(SiO2)、聚苯乙烯等材料虽能内化却未引发DNA损伤，而钨钴合金(WC/Co)通过氧化应激引发细胞毒性。该研究为纳米材料安全评估提供了"细胞摄取-毒性机制"关联分析新范式。

　　

在纳米技术迅猛发展的今天，工业用纳米材料已广泛应用于食品、医药、汽车等领域。然而这些直径小于100纳米的颗粒，因其独特的物理化学性质，可能通过未知途径进入生物系统并引发潜在风险。传统毒理学方法难以准确评估纳米材料的特殊生物效应，特别是细胞摄取与遗传毒性的关联机制尚不明确。这导致监管机构在制定安全标准时面临"数据缺口"困境——如何判断纳米颗粒是否真正进入细胞？内化后是否引发DNA损伤？这些核心问题直接关系到数万种纳米产品的安全应用。

英国斯旺西大学医学院(Swansea University Medical School)与荷兰Toxys BV公司的联合团队在《Mutagenesis》发表的重要研究，首次将超微结构分析与新型报告基因系统相结合，系统评估了10种工业相关纳米材料的生物效应。研究人员选取涵盖食品添加剂(TiO₂-E171)、医用材料(金纳米棒)、工业原料(碳黑、碳化钨)等不同领域的代表性纳米材料，通过透射电镜直观观测细胞摄取行为，同步采用ToxTracker小鼠胚胎干细胞(mES)报告系统检测DNA损伤、氧化应激等6种毒性终点，建立了"结构-摄取-毒性"的全链条评估体系。

关键技术方法包括：(1)动态光散射(DLS)表征材料在培养液中的团聚状态；(2)透射电镜(TEM)结合能谱分析(EDX)确认亚细胞定位；(3)ToxTracker六重报告基因系统定量检测DNA损伤(Bscl2-GFP/Rtkn-GFP)、氧化应激(Srxn1-GFP/Blvrb-GFP)等终点；(4)流式细胞术分析侧向散射(SSC)信号判断颗粒-细胞相互作用。所有实验均在无代谢活化系统(S9)条件下进行，设3次生物学重复。

主要研究结果

1. 纳米材料的细胞摄取特征
透射电镜揭示TiO₂-NM105、50nm聚苯乙烯、50nm二氧化硅和20nm碳黑可被mES细胞内化，其中：

• TiO₂-NM105以高度电子致密的晶体形式存在于60%细胞的胞质囊泡中(图3)，能谱证实含钛元素
• 聚苯乙烯颗粒在70%细胞内呈球形聚集，部分游离于胞质(图4)
• 碳黑颗粒仅10%细胞可见，能谱显示碳信号显著高于背景(图6)

2. 毒性效应谱分析
ToxTracker数据显示：

• 所有材料均未激活DNA损伤报告基因，提示无直接遗传毒性
• 钨钴合金(WC/Co)引发氧化应激(Srxn1-GFP激活)，但不伴随DNA损伤
• 金纳米棒独特地激活蛋白质应激报告基因(Ddit3-GFP)
• 聚苯乙烯在100μg/ml时仅引起10%细胞活力下降，而钨钴合金导致45%细胞死亡

3. 尺寸-形状-毒性关系
动态光散射证实：

• 聚苯乙烯和二氧化硅在培养液中保持50nm左右单分散状态(PDI<0.55)
• TiO₂-NM102因严重团聚(1614nm)未能内化，而较小团聚体的TiO₂-NM105(535nm)可被摄取
• 高长径比的金纳米棒(40×15nm)虽尺寸适宜但无法内化

这项研究首次证实：纳米材料的内化与否与其遗传毒性无必然关联。即使被细胞摄取的材料如TiO₂-NM105和聚苯乙烯，也未引发DNA损伤；而未内化的钨钴合金却通过溶解钴离子引发氧化应激。该发现颠覆了"纳米颗粒必须进入细胞才能发挥作用"的传统认知，提示表面相互作用和离子释放同样重要。研究建立的"TEM-ToxTracker"联用策略，为纳米材料安全评估提供了可标准化操作的新框架，其方法学创新尤其体现在：

1. 通过EDX能谱严格区分内化颗粒与细胞成分
2. 利用mES细胞同时评估多种毒性通路
3. 揭示材料形状(球形vs棒状)对摄取效率的决定作用

这些发现为欧盟化学品管理局(ECHA)正在制定的纳米材料测试指南提供了关键实验证据，特别是支持将细胞摄取分析纳入标准测试流程。未来研究可进一步探索纳米材料在长期暴露或代谢活化条件下的毒性演变规律，以及如何将这类体外数据用于人体风险评估。正如Stephen J. Evans等作者强调的，这项工作的核心价值在于"将纳米颗粒的物理命运与生物效应明确关联"，这种多模态分析方法将成为下一代纳米毒理学研究的黄金标准。