胡椒果实成熟过程中酚类成分动态变化及其抗氧化抗菌机制研究：基于UPLC-MS/MS与WGCNA的多组学分析

本研究系统分析了胡椒(Piper nigrum L.)果实成熟过程中酚类成分的动态变化及其生物活性，发现中熟期(210天)果实具有最佳生物活性成分积累，其中游离酚类表现出最强的ORAC和DPPH自由基清除活性，不溶性结合酚类对Pseudomonas fragi的抗菌效果最佳。通过WGCNA揭示了特定酚类与抗菌活性的显著正相关，为开发天然抗氧化剂和肉类防腐剂提供了理论依据。

　　

在食品保鲜和天然防腐剂开发领域，如何有效抑制腐败微生物特别是耐冷菌Pseudomonas fragi的生长一直是重大挑战。这种革兰氏阴性菌能在低温环境下快速繁殖，导致肉类、乳制品等食品腐败，造成巨大经济损失。同时，抗生素滥用导致的细菌耐药性问题也促使科研人员转向植物源抗菌剂的开发。胡椒作为全球消费量最大的香料，自古不仅用作调味品，还被作为民间药物和食品防腐剂使用，但其活性成分随成熟度的变化规律及作用机制尚不明确。

中国热带农业科学院香料饮料研究所的研究团队在《Food Chemistry: X》发表的研究，首次系统揭示了胡椒果实在不同成熟阶段(210天、240天、270天)四种酚类组分(游离型、酯化型、糖苷型、不溶性结合型)的动态变化规律及其抗氧化、抗菌机制。研究采用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)鉴定出586种酚类化合物，通过氧自由基吸收能力(ORAC)、DPPH自由基清除、脂质过氧化抑制实验评估抗氧化活性，并针对P. fragi进行最小抑菌浓度(MIC)、最小杀菌浓度(MBC)测定及细胞膜完整性、活性氧(ROS)水平等机制研究，最后运用加权基因共表达网络分析(WGCNA)和多因素分析(MFA)解析活性成分与功能的关联。

【主要技术方法】
研究选取中国海南万宁种植的胡椒果实，在三个成熟期采样后冻干处理。采用分级提取法获得四种酚类组分，通过Folin-Ciocalteu法和比色法测定总酚(TPC)和总黄酮含量(TFC)。抗氧化活性采用ORAC、DPPH和硫代巴比妥酸(TBA)法评估。抗菌实验通过琼脂稀释法测定MIC/MBC，结合激光共聚焦显微镜(LCM)和透射电镜(TEM)观察细胞形态变化，使用荧光探针DCFH-DA检测ROS水平。代谢组学数据通过WGCNA构建共表达网络，关键模块经MFA验证。

【研究结果】

3.1 总酚及总黄酮含量
中熟期(MM)果实总酚含量最高(10.53 mg GAE/g DW)，其中游离酚(4.17 mg/g)和不溶性结合酚(2.90 mg/g)占比最大。成熟过程中总酚呈下降趋势，但总黄酮在完全成熟期(FM)略有回升。

3.2 UPLC-MS/MS分析
鉴定出的586种酚类中，酚酸(40.1%)和黄酮(38.05%)为主。游离酚中黄酮占比达47%，而其他组分中酚酸超50%，证实植物酚酸多以结合形式存在。

3.4 抗氧化活性
游离酚表现出最强的ORAC(0.040 μM TE/L)和DPPH清除能力(IC₅₀=0.63 mg/mL)，而糖苷酚对脂质过氧化的抑制最显著(IC₅₀=0.31 mg/mL)。中熟期样品整体抗氧化活性最优。

3.5 抗菌活性
不溶性结合酚对P. fragi的抗菌效果最强(MIC=MBC=1 mg/mL)，显著优于文献报道的3-蒈烯(8.7 mg/mL)。机制研究表明：

• 粒径分析显示游离酚处理导致细菌聚集(双峰分布)
• 核酸(OD₂₆₀)和蛋白(OD₂₈₀)泄漏实验证实细胞膜损伤
• 糖苷酚处理8小时后使ROS水平提升5倍
• TEM观察到细胞膜破裂、胞质泄漏等超微结构改变

3.6 WGCNA关联分析
关键模块(turquoise)显示黄酮含量与抗菌指标(MIC/MBC)相关性最高(r>0.9)，酚酸、木脂素等与抗氧化参数(ORAC、脂质过氧化抑制)显著相关。MFA验证了这些化合物对生物活性的协同贡献。

【结论与意义】
该研究首次阐明胡椒果实中熟期(210天)是获取生物活性成分的最佳采收期，此时酚类物质积累最丰富且活性最强。研究发现不溶性结合酚虽含量不高，但抗菌效果突出，这颠覆了传统认为游离酚是主要活性成分的认知。通过多组学技术揭示的黄酮-抗菌活性强关联，为定向开发植物源防腐剂提供了分子靶点。

研究建立的"成熟度-成分-功能"分析框架，不仅适用于胡椒的品质评价和综合利用，也为其他药用植物的活性成分研究提供了范式。特别是发现糖苷化酚类通过诱导ROS爆发杀灭细菌的机制，为克服革兰氏阴性菌耐药性提供了新思路。这些发现对开发替代合成防腐剂的天然解决方案具有重要实践价值，相关成果已应用于指导海南产区胡椒的标准化采收和加工。