GmSZFP互作蛋白的筛选及GmERF7在大豆抵抗SMV侵染过程中的功能分析

　　

摘要：

【目的】大豆作为一种重要的经济和油料作物，其产量和品质常受大豆花叶病毒病的严重威胁，大豆花叶病毒病由大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus，SMV）引发。实验室前期筛选到一个差异表达的C₂H₂型单锌指蛋白基因GmSZFP，在大豆抵抗SMV侵染过程中发挥正调控作用。利用酵母双杂交文库筛选其互作蛋白，并探究互作蛋白在大豆与SMV互作过程中的功能，为进一步解析大豆抵御SMV侵染过程中转录因子的调控网络提供理论依据。【方法】以大豆品种冀豆7号、SMV毒株SC-8和N3组成的亲和、不亲和组合为试验材料，利用酵母双杂交文库筛选GmSZFP的潜在互作蛋白，借助酵母双杂交技术（Y2H）和双分子荧光互补试验（BiFC）验证二者的互作关系。运用实时荧光定量PCR（qPCR）和烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）介导的基因沉默技术（TRV-VIGS）分析潜在互作蛋白基因的表达特征及其在大豆与SMV互作过程中的功能。【结果】利用酵母双杂交文库筛选到GmSZFP的潜在互作靶蛋白GmERF7，Y2H和BiFC试验证明二者存在互作关系。GmERF7全长393个AA，包含一个AP2/ERF结构域和2个核定位（NLS）结构域；qPCR结果表明，在亲和组合中，GmERF7在接种病毒后4、12和24 h的表达水平显著高于不亲和组合，且在24 h时表达量达到峰值；利用VIGS技术沉默GmERF7，在亲和组合中，大豆叶片的接种部位有明显的胼胝质积累，而对照中几乎看不到胼胝质荧光；并且在接种后14 d，在基因沉默植株的上位叶中未检测到SMV外壳蛋白基因CP的表达，叶片未出现感染SMV症状，而在对照组中检测到CP的表达，并出现花叶、失绿等感病症状。以上结果表明，沉默GmERF7降低了SMV对大豆植株的侵染能力，增强了大豆对SMV的抗性，说明GmERF7负调控大豆的抗病性。【结论】ERF类转录因子GmERF7能够与锌指蛋白GmSZFP互作，在大豆与SMV互作过程中负调控大豆对SMV的抗性。