通过TP53与DNA甲基化双重抑制实现Cas9介导的基因组编辑中女性hPSC高效XIST再激活

本研究针对女性人类多能干细胞(hPSC)中X染色体失活(XCI)不可逆侵蚀这一关键问题，开发了通过短暂抑制TP53和DNA甲基化(DNAme)来显著提高Cas9介导的非同源末端连接(NHEJ)编辑效率的新策略。研究人员通过双重抑制方法将XIST阳性细胞比例从5%提升至43.7%，为稳定XCI状态提供了可靠方案，解决了女性hPSC在疾病建模和临床应用中的X连锁基因异常表达难题。

　　

在干细胞研究和再生医学领域，女性人类多能干细胞(hPSC)长期面临一个棘手难题：培养过程中X染色体失活(XCI)状态的不可逆丢失。这种现象源于X失活特异性转录本(XIST)这一长链非编码RNA的表观沉默，导致X染色体上500多个基因的双等位激活和异常表达。这种"XCI侵蚀"不仅影响干细胞分化命运，更对疾病建模特别是X连锁疾病研究造成严重干扰，例如Rett综合征(RTT)等神经发育疾病。更令人担忧的是，X染色体上众多癌症相关基因的异常表达，给基于女性hPSC的临床应用带来了安全隐患。

日本东海大学医学院分子生命科学系和国立儿童健康与发展中心的研究团队在《Stem Cell Research》发表的研究中，开发了一种革命性的双重抑制策略。研究人员巧妙结合TP53抑制和DNA甲基转移酶1(DNMT1)抑制剂GSK3685032处理，在Cas9介导的基因组编辑过程中，将XIST再激活效率从常规方法的5%大幅提升至43.7%。这项突破性工作不仅解决了女性hPSC应用中长期存在的表观遗传不稳定问题，更为精准疾病建模和安全临床应用提供了可靠解决方案。

研究采用了几项关键技术方法：通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析分化细胞的XIST表达模式；利用CRISPR-Cas9系统进行XIST启动子区域靶向编辑；采用DNMT1特异性抑制剂GSK3685032进行DNA甲基化动态调控；通过RNA荧光原位杂交(RNA-FISH)和免疫荧光(IF)验证XCI状态；使用10x Genomics平台进行单细胞转录组分析。研究样本包括Rett综合征患者来源的iPSC和RIKEN生物资源中心提供的10株质量控制女性hiPSC系。

"NHEJ介导的XIST再激活在女性hPSC分化细胞中维持稳健表达"部分研究发现，通过非同源末端连接(NHEJ)方法再激活XIST的分化细胞能稳定维持XIST表达，而通过同源定向修复(HDR)方法插入选择标记的细胞则出现XIST表达下降。单细胞分析显示，HDR方法产生的分化细胞中XIST阳性细胞比例不足20%，且XIST foci显著缩小。更重要的是，X连锁基因模块评分分析证实HDR方法导致X连锁基因异常高表达，这可能影响疾病表型的准确模拟。

"通过Cas9介导的NHEJ过程中双重抑制TP53和DNA甲基化维持显著提高XIST再激活效率"部分揭示了关键机制突破。研究人员发现单独抑制TP53或DNMT1效果有限(<5%)，但双重抑制可协同提升效率至28%。通过优化GSK3685032处理时间(预处理48小时/后处理72小时)，最终获得43.7%的XIST阳性细胞。从这些细胞中分离的三个亚克隆系(4e、5d和6f)显示超过80%细胞具有H3K27me3标记的XCI特征，且97%细胞检测到X连锁基因HUWE1的单等位表达，证实XCI成功重建。

"XCI重建女性hPSC的可扩展培养和重现性"部分证明了方法的普适性。在ROCK抑制剂辅助下，XCI重建细胞可扩增至1×10⁷数量级，同时维持XCI状态。该方法在RIKEN BRC提供的多株女性hiPSC中同样有效，在4115和3810-iPSC系中实现约33%的XCI重建效率，展示了良好的重现性。

这项研究的重要意义在于：首次阐明DNA甲基化维持(而非从头甲基化)是Cas9编辑后XIST重新沉默的关键机制；开发出通过短暂双重抑制显著提升XIST再激活效率的创新策略；证实NHEJ方法比HDR更有利于维持长期XIST表达；为女性hPSC的精准疾病建模和临床应用扫除了重要障碍。特别是对Rett综合征等X连锁疾病研究，稳定的XCI状态可确保疾病表型的准确重现。虽然短暂TP53抑制可能带来基因组稳定性顾虑，但研究团队强调该方法仅限编辑窗口期使用，并通过亚克隆筛选确保最终产品安全性。这项成果为干细胞生物学和再生医学领域提供了解决性别差异问题的典范，将推动女性特异性疾病研究和个体化医疗发展。