酿酒酵母拓扑异构酶II三闸门构象动态及其对DNA、核苷酸和依托泊苷的响应机制研究

本研究通过单分子FRET技术首次直接观测了真核生物拓扑异构酶II（Topo II）N-gate、DNA-gate和C-gate的构象变化，揭示了核苷酸结合诱导N-gate关闭、DNA和抗癌药物依托泊苷（etoposide）触发DNA-gate/C-gate开放的分子机制，为理解Topo II的ATP依赖性DNA松弛/解连环作用及药物靶向设计提供了动态结构基础。

　　

在细胞生命活动中，DNA拓扑结构的精确调控至关重要。真核生物拓扑异构酶II（Topo II）作为关键的分子机器，通过ATP依赖性反应催化DNA松弛和解连环，其功能异常与癌症等疾病密切相关。尽管已知Topo II通过"链传递机制"（strand-passage mechanism）发挥作用，涉及N-gate、DNA-gate和C-gate三个蛋白质界面的协同开闭，但这些动态构象变化始终未被直接观测。更关键的是，抗癌药物依托泊苷（etoposide）等如何通过影响闸门动态发挥药效，仍是未解之谜。

德国明斯特大学（University of Münster）的研究团队在《Journal of Biological Chemistry》发表的重要研究中，创新性地将单分子荧光共振能量转移（FRET）技术与位点特异性标记策略相结合，首次实现了对酿酒酵母（S. cerevisiae）Topo II三个闸门构象的动态追踪。研究人员首先构建了仅保留表面可及半胱氨酸的"半胱氨酸精简版"（Cys-lite）Topo II，通过在N-gate（S16/E155）、DNA-gate（K804/Q807）和C-gate（K1134/Q1135）两侧引入荧光供体/受体，系统分析了不同生理状态下各闸门的距离变化。

研究揭示了三重闸门的精密协作机制：在无配体状态下，N-gate呈开放构象（FRET效率0.2-0.35），而DNA-gate和C-gate保持关闭（FRET效率0.65-0.9）。非水解ATP类似物ADPNP结合可诱导N-gate关闭（FRET效率升至0.5-1.0），而ATP存在时则呈现动态平衡状态。尤为重要的是，DNA结合会触发DNA-gate出现"紧闭"（FRET 0.7）和"松弛"（FRET 0.5）两种构象，抗癌药依托泊苷更将DNA-gate稳定在开放状态（距离增加>5?）。C-gate则在DNA存在时出现开放构象（FRET从0.9降至0.5），且依托泊苷能进一步破坏其稳定性。

这些发现为理解Topo II的工作机制提供了三点关键启示：首先验证了"双锁规则"（double-lock rule），即闸门开闭存在严格级联调控；其次揭示了药物通过锁定DNA-gate开放状态来增强DNA切割的分子基础；最后阐明了不同闸门间的变构耦合机制，为开发靶向特定构象状态的新型抗癌药物奠定了理论基础。该研究不仅解决了拓扑异构酶领域长期存在的动态观测难题，更为优化化疗药物设计提供了精准的结构动态蓝图。