基于UHPLC-HRMS和新型手性衍生化技术的人唾液DL-硫醇动态分析揭示吸烟者氧化应激特征

本研究针对吸烟所致氧化应激缺乏动态生物标志物的难题，开发了基于NCS-OTPP手性衍生化的UHPLC-HRMS新方法，实现了唾液GSH/Cys/Hcy/γ-Glu-Cys四种DL-硫醇的同步分离（分辨率1.60-1.89），检测限达2.50-14.40 fmol。首次发现吸烟者L-GSH/DL-Cys/L-Hcy浓度显著升高（p<0.05）且15分钟恢复的动态规律，为氧化应激相关疾病的早期诊断提供了新思路。

　　

吸烟作为全球公共卫生难题，每年导致约60万人死亡，其产生的活性氧簇（ROS）会破坏机体氧化还原平衡。虽然已知硫醇类化合物如谷胱甘肽（GSH）在抗氧化防御中起关键作用，但关于吸烟后手性硫醇动态变化的研究仍是空白。更棘手的是，传统色谱技术难以实现D/L型硫醇异构体的高效分离，而现有衍生化试剂又存在灵敏度不足或成本高昂等问题。这些技术瓶颈严重阻碍了通过唾液生物标志物监测吸烟相关氧化应激的进展。

针对这一系列挑战，吉林大学的研究团队在《Journal of Chromatography A》发表创新成果。他们自主研发了(R)-(5-(3-异硫氰酸吡咯烷-1-基)-5-氧戊基)三苯基膦（NCS-OTPP）手性衍生化试剂，结合超高效液相色谱-高分辨质谱（UHPLC-HRMS）技术，建立了同时检测唾液中GSH、Cys、Hcy和γ-Glu-Cys四种DL-硫醇的新方法。通过优化YMC Triart C₁₈色谱柱（2.0×150 mm, 1.9 μm）的等度洗脱条件（65:35的0.1%甲酸水溶液与甲醇-乙腈混合液），使分离度达到1.60-1.89，检测限突破至fmol级。应用该方法对10名吸烟者和10名非吸烟者的纵向分析，首次揭示了吸烟后手性硫醇代谢的时空动态规律。

关键技术包括：1）新型NCS-OTPP手性衍生化技术增强质谱响应；2）UHPLC-HRMS联用实现高灵敏度分离；3）建立吸烟者-非吸烟者配对队列的动态监测方案。

【材料与方法】研究采用自主研发的NCS-OTPP试剂，其分子中的三苯基膦基团显著提升电离效率，而异硫氰酸基团可特异性结合硫醇。通过优化衍生化反应条件，使四种目标物在15分钟内完成基线分离。

【结果】方法学验证显示优异性能：线性范围0.5-20 μM（R²≥0.9992），加标回收率92.15-106.22%。吸烟组数据分析发现：L-GSH、DL-Cys和L-Hcy浓度较非吸烟组显著升高（p<0.05），且在吸烟后15分钟内恢复至基线水平。动态监测曲线与拟合曲线高度吻合。

【结论】该研究突破了三重技术壁垒：1）解决手性硫醇分离难题；2）实现fmol级超微量检测；3）首次建立吸烟相关氧化应激的动态评估模型。不仅为疾病早期预警提供新思路，其NCS-OTPP衍生化策略更为生物样本中手性化合物的分析开辟了新途径。值得注意的是，γ-Glu-Cys作为GSH合成前体的异常波动，可能成为吸烟所致氧化损伤的新型标志物，这为后续机制研究指明了方向。