酶特异性酪蛋白水解物增强钙吸收与骨矿化的机制：基于成骨细胞激活及肽谱解析的突破性研究

为解决传统钙补充剂吸收效率低、骨骼健康维护困难的问题，研究人员聚焦酶特异性酪蛋白(CN)水解物对钙转运通路(如TRPV5/TRPV6)和骨代谢的影响展开研究。通过细胞与动物模型，发现木瓜蛋白酶水解物显著提升钙吸收率1.8倍血清骨钙素(OCN)，降低41%抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)，并恢复骨小梁微结构，为骨质疏松干预提供新型功能性营养品开发策略。

　　

钙是维持骨骼健康、神经传导和肌肉收缩的关键元素，但传统钙补充剂如氯化钙(CaCl₂)常因肠道沉淀和缺乏协同因子导致生物利用度不足，全球约29%绝经后女性和13.5%老年男性面临骨质疏松风险。这一问题在快速生长期人群（如婴幼儿和老年人）中尤为严峻，亟需高效促进钙吸收与骨形成的解决方案。酪蛋白(CN)作为牛奶主要蛋白，其酶解产物可生成生物活性肽，但不同蛋白酶因切割偏好性产生差异肽段，影响钙代谢效率。为此，大连工业大学的研究人员通过系统性实验，揭示了木瓜蛋白酶特异性水解CN的肽段如何靶向调控钙转运通道和骨细胞活性，显著提升骨矿化效果，该成果发表于《Journal of Dairy Science》，为精准设计抗骨质疏松营养品奠定基础。

研究采用多学科技术整合：细胞实验以小鼠胚胎成骨前体细胞(MC3T3-E1)和人结肠癌细胞(Caco-2)评估水解物对增殖、碱性磷酸酶(ALP)活性及钙通道蛋白表达的影响；动物实验使用低钙饮食诱导的骨质疏松小鼠模型，分组灌胃不同酶解物（木瓜蛋白酶、胰蛋白酶等），监测体重、股骨参数及血清标志物（钙、磷、ALP、TRAP）；分子机制通过Western blot分析十二指肠TRPV5/TRPV6表达；结构验证采用微计算机断层扫描(micro-CT)量化骨小梁密度；肽组成通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)和虚拟酶切(BIOPEP-UWM数据库)解析。

Effects of Different Enzymatic Hydrolysates on Osteoblast Cells
研究显示，不同酶解物（如胰蛋白酶和菠萝蛋白酶）在100 μg/mL浓度下显著促进MC3T3-E1细胞增殖（P < 0.05），但木瓜蛋白酶组未显优势；然而，菠萝蛋白酶水解物提升ALP活性最高，表明其通过激活骨合成通路（如TGF-β1/Smad）增强成骨分化。

Effects of Different Enzymatic Hydrolysates on the Activation of Calcium Pathway
在Caco-2细胞中，木瓜蛋白酶和中性蛋白酶水解物显著上调TRPV5/TRPV6钙通道蛋白表达（P < 0.05），促进肠钙转运；动物实验证实木瓜蛋白酶组小鼠血清钙水平最高，较CaCl₂组提升显著，凸显其肽段（如RELEELNVPGEIVE）的钙螯合能力。

Analysis of BW and Femur in Mice
低钙模型组小鼠体重、股骨长度/直径均低于对照组（P < 0.05），而各酶解物干预组均逆转此趋势，但组间无差异，表明CN水解物普遍改善钙缺乏症状。

Analysis of ALP Activity, Calcium Content, Phosphorus Content, and TRAP Activity in Mice Serum
模型组血清ALP和TRAP活性升高反映骨钙动员，木瓜蛋白酶组血清钙水平较CaCl₂组显著增加（P < 0.05），且TRAP降低41%，证实其抑制破骨细胞活性优于无机钙。

CT Analysis of Femur in Mice
Micro-CT三维重建显示模型组骨小梁结构稀疏，木瓜蛋白酶组骨矿密度(BMD)、骨体积分数(BV/TV)和骨小梁数量(Tb.N)恢复至正常水平，而CaCl₂组无改善，说明酶解肽通过整合素-PI3K/Akt通路促进骨基质沉积。

Expression of Calcium Pathway Protein in Mice
十二指肠Western blot揭示木瓜蛋白酶和胰蛋白酶组TRPV5/TRPV6表达最高（P < 0.05），解释其钙吸收优势；相比之下，CaCl₂仅依赖被动转运，易致高钙血症。

Difference of Peptides in Different Hydrolysates
肽谱分析表明木瓜蛋白酶偏好切割谷氨酸/赖氨酸富集位点（如ES、EK），生成钙结合肽QPKTKVIPYVRYL；尽管胰蛋白酶组酪蛋白磷酸肽(CPP)含量最高，木瓜蛋白酶的低CPP但高活性肽凸显酶特异性切割的核心作用。

研究结论表明，木瓜蛋白酶水解CN通过双重机制优化钙代谢：上调TRPV6介导的主动钙转运和释放骨形成促进肽，显著恢复骨质疏松模型骨微结构。其意义在于建立“酶-肽-活性”框架，克服传统钙剂的局限性，为开发靶向营养品提供转化路径，未来需聚焦非CPP肽段的临床验证。