基于功能失调T细胞表型筛选的高通量免疫检查点调节剂评估体系建立

本研究针对慢性感染和肿瘤中T细胞功能失调的临床难题，建立了从人外周血单个核细胞（PBMCs）诱导功能失调T细胞的标准化方案，开发了384孔板全自动高通量检测平台，通过AlphaLISA技术检测IL-2/IFN-γ分泌和细胞活力双重指标，成功筛选出2种能逆转T细胞衰竭的小分子化合物，为免疫检查点调节剂（ICMs）开发提供了新工具。

　　

在对抗慢性病毒感染和肿瘤的持久战中，T细胞往往会陷入"精疲力竭"的状态——这种现象在免疫学上称为T细胞衰竭（T cell exhaustion）。就像长期加班导致工作效率下降的上班族，这些T细胞不仅分泌细胞因子（如IL-2和IFN-γ）的能力大幅减弱，还会在表面挂满"请勿打扰"的标牌：PD-1、Tim-3、LAG-3等免疫检查点分子。虽然现有的PD-1/PD-L1阻断抗体已在临床上取得突破，但响应率低、耐药性和毒副作用等问题仍困扰着研究者。如何从海量化合式中快速筛选出新型免疫调节剂，成为打破治疗瓶颈的关键。

Amgen Inc.的研究团队在《Journal of Immunological Methods》发表的研究中，开发了一套创新的解决方案。他们首先建立人外周血单个核细胞（PBMCs）体外诱导T细胞衰竭模型：用植物血凝素（PHA-L）和IL-2持续刺激10天，模拟慢性抗原暴露环境。随后构建384孔板全自动检测体系，通过AlphaLISA技术同步检测T细胞受体（TCR）激活后的IL-2/IFN-γ分泌水平及细胞活力，实现高通量筛选。在验证的15种靶向不同通路的化合物中，成功发现2种能显著恢复衰竭T细胞功能的小分子。

关键技术方法包括：1）采用PHA-L+IL-2诱导PBMCs建立T细胞衰竭模型；2）流式细胞术表征PD-1⁺Tim-3⁺双阳性细胞群；3）建立抗CD3/CD28刺激的384孔板检测体系；4）AlphaLISA技术定量IL-2和IFN-γ；5）同步检测细胞毒性。

【Dysfunctional T cell preparation】研究显示，持续10天的PHA-L刺激可使PBMCs中PD-1表达率提升5倍，且CD4⁺/CD8⁺ T细胞均呈现典型衰竭表型。通过冻存复苏验证，该模型保持稳定的表型特征，批间差异小于15%。

【Dysfunctional T cell preparation】团队发现单纯CD3交联不足以诱导深度衰竭，而PHA-L通过多价交联TCR复合物，更有效模拟慢性抗原刺激。优化后的培养基配方（含4 ng/mL IL-2）既能维持细胞存活，又避免过度活化。

【Discussion】该研究创新性地将原代T细胞衰竭模型与高通量筛选相结合，相比传统靶向筛选，表型筛选能发现作用于未知靶点的先导化合物。发现的2个活性化合物通过非PD-1/PD-L1通路增强TCR信号，为联合治疗提供新选择。

这项研究的重要意义在于：首次建立可规模化的原代T细胞表型筛选平台，解决传统方法耗时长、通量低的痛点；证实PHA-L诱导模型能较好模拟体内衰竭特征；为开发下一代免疫检查点调节剂提供标准化评估工具。作者在讨论中指出，该体系未来可扩展至其他免疫细胞亚群的功能评估，并有望通过多参数检测发现更精准的生物标志物。尽管目前筛选规模有限，但这一技术路线为加速肿瘤免疫治疗药物开发开辟了新途径。