基于脱细胞肌肉支架构建功能性神经肌肉类器官模型及其在杜氏肌营养不良症研究中的应用

本研究通过结合组织工程与人诱导多能干细胞(hiPSC)技术，创新性地利用脱细胞骨骼肌(dSkM)支架成功构建了具有功能性神经肌肉连接的组织工程神经肌肉类器官(t-NMO)。该模型不仅实现了神经与肌肉组分的空间区室化，还能模拟Duchenne肌营养不良症(DMD)的病理特征，为研究人类神经肌肉系统发育和疾病建模提供了重要平台。

　　

神经肌肉系统的发育和功能依赖于多种细胞类型与细胞外基质(ECM)间复杂的相互作用。然而，现有的体外模型难以同时模拟内在细胞特性和外在ECM环境，这严重制约了对神经肌肉系统生物学基础研究和疾病机制探索的进展。特别是对于杜氏肌营养不良症(DMD)这类神经肌肉疾病，缺乏能够再现患者特异性病理特征的体外模型，阻碍了治疗方法的开发。

为突破这一瓶颈，意大利帕多瓦大学(University of Padova)的研究团队创新性地将组织工程与人诱导多能干细胞(hiPSC)技术相结合，开发出组织工程神经肌肉类器官(t-NMO)模型。研究人员利用脱细胞骨骼肌(dSkM)作为生物支架，通过优化的小分子诱导分化方案，使hiPSC在30天内分化为具有功能连接的神经肌肉组织。该研究成果发表在《Communications Biology》上，为研究人类神经肌肉系统(功能)障碍提供了重要工具。

研究采用了多项关键技术：1)利用原子力显微镜(AFM)表征dSkM的机械性能；2)建立hiPSC向神经肌肉系统的多阶段分化方案；3)结合活细胞成像和粒子图像测速(PIVlab)分析收缩功能；4)应用RNA测序进行转录组分析；5)采用患者特异性hiPSC构建疾病模型。特别值得注意的是，研究纳入了4例DMD患者和3例健康供体的细胞样本进行对比研究。

【DSkMs allow the derivation of tissue-engineered NMOs(t-NMO)】
研究证实dSkM能支持hiPSC的多能性维持和向中胚层/神经中胚层谱系的分化。AFM分析显示dSkM保留了天然组织的力学特性。分化30天后，t-NMO形成具有自发收缩功能的3D结构，钙成像显示存在基础电活动。

【Myofiber differentiation and functionality is promoted by dSkM】
t-NMO包含PAX7⁺肌肉干细胞(10%总细胞)、MYOG⁺成肌细胞和成熟肌纤维。RNA-seq分析显示dSkM促进肌纤维细胞骨架相关基因(如MYH2和MYH8)表达上调，与无支架模型相比，t-NMO的肌纤维更粗长且收缩力更强。

【t-NMOs possess multiple neural cell types and show complex extension of neuritic projections】
t-NMO含有PAX6⁺SOX2⁺神经前体细胞和成熟神经元(NEUN⁺MAP2⁺)，其中运动神经元标志物MNX1/HB9表达上调。dSkM促进神经突延长增粗，形成复杂神经网络。

【T-NMOs present NMJ elements and functional neuromuscular interaction】
t-NMO显示α-银环蛇毒素(BTX)⁺乙酰胆碱受体(AChR)簇与突触小泡蛋白2(SV2)⁺神经末梢共定位。谷氨酸刺激可诱发肌肉收缩，该反应可被肉毒杆菌毒素(BoNTA)和BTX阻断，证实存在功能性神经肌肉连接。

【DMD-derived t-NMOs display altered muscular activity upon neurotransmitter stimulation】
使用DMD患者hiPSC构建的t-NMO再现了疾病特征：肌营养不良蛋白缺失、收缩力减弱、钙瞬变异常。四种不同突变类型(DMD1：外显子61无义突变；DMD2-4：不同外显子缺失)的DMD模型均显示钙信号恢复延迟。

这项研究开创性地将脱细胞基质应用于类器官工程，解决了现有神经肌肉模型在结构和功能上的局限性。t-NMO模型不仅实现了神经与肌肉组分的空间组织，还能模拟DMD的病理特征，为研究神经肌肉系统发育和疾病机制提供了重要平台。特别是该技术能够使用患者特异性细胞构建疾病模型，为个性化医疗和药物筛选开辟了新途径。研究证实dSkM提供的ECM微环境能促进细胞归巢、神经突生长和肌肉成熟，这一发现为组织工程和再生医学提供了新思路。未来，这种类器官技术有望应用于更多神经肌肉疾病的研究和治疗开发。