γ-变形菌Dickeya dadantii中内膜蛋白OutB通过L,D-转肽酶介导与肽聚糖共价连接的分子机制研究

本研究揭示了植物病原菌Dickeya dadantii中内膜蛋白OutB通过Lpp样盒结构域与肽聚糖(PG)共价连接的创新机制。研究人员发现L,D-转肽酶Ldt03/Ldt84特异性催化OutB与PG单体和二聚体的交联，并通过调控Lpp长度改变周质空间几何构象影响连接效率。该发现拓展了对细菌包膜稳定机制的认识，为革兰氏阴性菌细胞壁锚定系统提供了新范式。

　　

在细菌与宿主的军备竞赛中，细胞包膜的完整性是革兰氏阴性菌生存的第一道防线。传统认知认为，外膜脂蛋白Lpp通过共价连接肽聚糖(PG)层维持包膜稳定，而内膜蛋白如何参与这一过程仍是未解之谜。Dickeya dadantii作为重要的植物病原菌，其2型分泌系统(T2SS)关键组分OutB的异常定位现象，为揭示内膜蛋白与细胞壁的相互作用提供了独特线索。

法国国家科学研究中心(CNRS)的研究团队通过多学科方法，首次证实内膜蛋白OutB可通过C端Lpp样盒(VRTKK)与PG共价连接。研究发现：1) Ldt03偏好催化OutB与PG单体连接，Ldt84倾向介导二聚体交联；2) 延长Lpp+21可增加周质空间宽度，显著提升OutB-PG连接效率；3) Lpp样盒具有显著氨基酸替代耐受性，可引导报告蛋白β-内酰胺酶(BlaM)实现PG锚定。该成果发表于《Communications Biology》，为细菌包膜组装机制提供了新认知。

关键技术包括：1) 肽聚糖质谱分析鉴定Lys-Lys修饰的胞壁肽；2) 基因敲除构建ldt03/ldt84双突变体；3) 透射电镜观察Lpp长度变异株的包膜形态；4) 蛋白质印迹定量PG结合型OutB含量；5) 扫描电镜分析细胞表面拓扑结构。

Lpp_Dd与OutB在D. dadantii PG上的共价连接
通过热SDS法提取PG并结合溶菌酶/PGRP酰胺酶消化，免疫印迹检测到OutB与muropeptide的共价复合物。质谱分析揭示Tri→Lys-Lys和Tetra→Tri→Lys-Lys两种修饰形式，证实连接位点为C端Lys²¹⁹-Lys²²⁰。

Lpp样盒是OutB连接PG的必要充分条件
缺失实验显示仅保留13个残基的CTE片段(OutBΔC)仍保持PG连接能力。将OutB的CTE结构域与β-内酰胺酶融合后，Bla-CTE仍可有效锚定PG，证明Lpp样盒具有独立功能。

Lpp样盒的氨基酸替代耐受性
C端Lys²²⁰缺失突变体(OutB_K220tga)通过Lys²¹⁹维持连接，而LppΔ58K的PG结合活性下降50倍。T218Y突变可增强Bla-CTE的PG锚定效率，表明连接活性受局部微环境影响。

内膜锚定对OutB-PG连接非必需
去除跨膜段(TMS)的分泌型OutB_SP仍可通过溶菌酶/PGRP处理产生30 kDa和25 kDa的PG结合片段，证实膜定位非连接必需条件。

Lpp_Dd长度改变影响包膜完整性
缩短21个残基的LppΔ21导致细胞缩短、黏液表型和运动缺陷，而Lpp+21增加SDS敏感性。电镜显示LppΔ21突变体产生极性凹陷，Lpp+21使PG层更靠近内膜。

Ldt03/Ldt84介导特异性连接
双敲除实验证明Ldt03偏好单体连接(79.1% Tri→Lys-Lys)，Ldt84倾向二聚体交联(72.0% Tetra→Tri→Lys-Lys)。大肠杆菌LdtA/LdtB分别呈现类似Ldt84/Ldt03的底物偏好性。

OutB在植物感染中的应激表达
PhoP/OmpR调控系统激活时OutB表达显著增强，在腐烂菊苣叶片中与分泌素OutD协同高表达，暗示其在包膜应激响应中的特殊作用。

该研究突破性地揭示了内膜蛋白参与PG锚定的新机制，其发现具有三重意义：1) 阐明L,D-转肽酶对底物构型的精细识别规律；2) 证明周质空间几何约束对蛋白-PG连接的关键调控作用；3) 为工程化改造细菌包膜提供了Lpp样盒这一通用锚定工具。这些发现不仅深化了对细菌形态维持机制的理解，也为开发新型抗菌策略提供了分子靶点。