基于共识抗原设计的长链α-神经毒素广谱中和性VHH抗体的结构机制研究

本研究针对蛇毒中长链α-神经毒素(α-neurotoxins)的抗原变异难题，通过设计共识毒素LCC作为抗原，利用噬菌体展示技术筛选出21种具有交叉反应性的单域抗体(VHH)。其中TPL1158_01_C09展现出最强的广谱中和能力，其与α-眼镜蛇毒素(α-cobratoxin)的共晶结构揭示了受体模拟的中和作用机制。该研究为开发广谱抗蛇毒血清提供了新策略，发表于《Communications Chemistry》。

　　

每年全球约有10万人死于蛇咬伤中毒，这种被忽视的热带疾病主要由于蛇毒中复杂的蛋白质毒素混合物引起。其中长链α-神经毒素(long-chain α-neurotoxins)是眼镜蛇科(elapid)毒液中最危险的神经毒素成分，能不可逆地阻断神经肌肉接头的烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)。然而，不同蛇种间毒素存在显著的抗原变异(antigenic variation)，这给传统抗蛇毒血清的开发带来巨大挑战。

针对这一难题，丹麦技术大学(Technical University of Denmark)的研究团队创新性地采用共识抗原设计策略，开发出能诱导广谱中和抗体(broadly neutralising antibodies, bnAbs)的合成毒素。研究人员首先从14种非洲眼镜蛇科毒蛇的长链α-神经毒素序列中，通过生物信息学分析设计出代表该亚家族平均特征的共识毒素LCC(long-chain consensus α-neurotoxin)。这种人工设计的毒素在酵母表达系统中成功表达，并保留了天然毒素的结构特征，其圆二色谱(CD)显示与天然α-眼镜蛇毒素相似的二级结构。

研究采用噬菌体展示技术从免疫骆驼科动物文库中筛选出21个特异性结合LCC的单域抗体(VHH)，通过生物层干涉仪(BLI)和解离增强镧系荧光免疫分析(DELFIA)评估发现，这些抗体能交叉识别多种天然长链α-神经毒素。其中TPL1158_01_C09表现最为突出，对Naja kaouthia的α-cobratoxin、Dendroaspis viridis的Dv4和Naja nivea的Nn8的平衡解离常数(KD)分别达到1.54 nM、1.20 nM和0.63 nM。体外电生理实验证实，该抗体能有效保护nAChR功能，中和多种毒素的抑制作用。更令人振奋的是，在小鼠模型中，TPL1158_01_C09不仅能预防性中和3倍致死剂量(LD₅₀)的α-cobratoxin，还能在毒素注射5分钟后进行"抢救"治疗，完全避免小鼠死亡。

研究人员通过X射线晶体学解析了TPL1158_01_C09与α-cobratoxin的复合物结构(PDB:9GCN)，分辨率达到3?。结构分析显示，该抗体的互补决定区(CDR)特别是CDR-H3环通过芳香族残基(Y100、Y102和W99)模拟nAChR受体α1亚基的环C结构(F189、Y190和Y198)，形成类似的结合界面。分子动力学(MD)模拟进一步证实，这种受体模拟机制在不同毒素中高度保守，解释了其广谱中和能力的结构基础。

关键技术方法包括：1)基于14种天然毒素序列设计共识抗原LCC；2)利用酵母表达系统生产重组LCC；3)采用噬菌体展示技术筛选免疫VHH文库；4)通过BLI和DELFIA评估抗体亲和力与交叉反应性；5)运用X射线晶体学和MD模拟解析中和机制；6)开展体外电生理和体内小鼠模型验证中和效果。

研究结果部分：

1. LCC代表设计中所包含的长链α-神经毒素的平均特征
   通过AlphaFold2预测显示LCC保持了天然毒素的三指折叠结构(three-finger fold)，核心β-片层结构高度保守，与天然毒素的均方根偏差(RMSD)平均仅1.8?。

2. 从免疫骆驼科动物库中有效筛选VHH
   从两个免疫美洲驼的混合文库中，通过两轮噬菌体展示筛选获得186个克隆，其中88个显示阳性结合信号，最终鉴定出26个独特VHH序列。

3. 筛选的VHH能结合多种天然长链α-神经毒素
   DELFIA检测显示，优选VHH能识别来自不同蛇种的毒素，包括α-bungarotoxin(仅62%序列相似性)，但对细胞毒性三指毒素(cytotoxic 3FTx)无交叉反应。

4. 选定克隆的结合亲和力
   BLI测定显示TPL1158_01_C09对多种毒素的KD在亚纳摩尔级，其中对Nn8的亲和力最高(KD=0.63 nM)。

5. 选定VHH在体外中和毒性
   受体结合抑制实验和全细胞膜片钳证实，TPL1158_01_C09能完全阻断毒素与nAChR结合，恢复电生理信号，中和所有测试毒素。

6. 选定VHH在体内中和毒性
   小鼠实验证明TPL1158_01_C09能完全中和3×LD₅₀的α-cobratoxin，在预防和抢救模式下均显示100%保护率。

7. 广谱中和能力的结构基础
   晶体结构显示VHH通过盐桥(VHH-D27与α-cobratoxin-R36)和氢键网络模拟nAChR结合界面，MD模拟证实这一机制在不同毒素中保守。

这项研究首次证明，通过合理设计的共识毒素作为抗原，能够诱导出具有广谱中和能力的单域抗体。与传统抗蛇毒血清相比，这种重组抗体具有多重优势：生产过程标准化、批次间差异小、无需冷链储存，且可通过组合少数VHH实现多价覆盖。更重要的是，该研究揭示的受体模拟机制为设计针对其他毒素家族的广谱中和抗体提供了范式。从更广泛的意义看，这种共识抗原策略也可应用于病毒、细菌等多变病原体的抗体开发，为应对全球健康挑战提供新思路。