嗜碱外硫红杆菌(Exiguobacterium sp. AB2)Argonaute核酸酶的随机引导非依赖性DNA切割特性及其在细菌免疫中的潜在作用

本研究针对原核生物Argonaute(pAgo)蛋白在细菌免疫中的功能机制展开探索。菲律宾大学的研究团队从嗜碱外硫红杆菌(Exiguobacterium sp. AB2)基因组"防御岛"中发现新型pAgo蛋白EsAgo，通过结构预测和体外实验证实其具有Mn2+依赖的随机质粒降解活性，且催化位点双突变体(D495A/D564A)显著减弱该活性。研究首次报道5'-P ssDNA引导可抑制EsAgo的非特异性切割，为理解pAgo的免疫防御机制及开发新型可编程核酸酶提供了新见解。论文发表于《BMC Microbiology》。

　　

在细菌与噬菌体持续演化的"军备竞赛"中，原核Argonaute(pAgo)蛋白作为核酸引导的核酸酶，被认为是细菌抵御可移动遗传元件(MGEs)入侵的重要防御系统。然而目前对pAgo的生理功能认识仍有限，特别是其如何区分"自我"与"非我"DNA的机制尚不明确。更棘手的是，多数已鉴定的pAgo来自嗜热菌，限制了其在常温条件下的应用潜力。

菲律宾大学国家分子生物学与生物技术研究所的研究人员从菲律宾Pangasinan的Manleluag蛇绿岩泉分离的嗜碱外硫红杆菌(Exiguobacterium sp. AB2)中发现新型pAgo蛋白EsAgo。该基因位于基因组"防御岛"中，与DISARM系统、Wadjet系统等已知防御基因相邻。通过多序列比对和蛋白结构建模，发现EsAgo具有典型长A型pAgo特征：完整的N-PAZ-MID-PIWI结构域、YKQXNK型DNA结合基序和DEDD催化四联体。AlphaFold预测显示其能形成双叶结构，与DNA/RNA靶标结合的模型与已解析的Kurthia massiliensis Ago结构高度重叠。

研究采用的关键技术包括：基因组防御系统注释(PADLOC工具)、多序列比对与系统发育分析(MEGA12)、蛋白质结构预测(AlphaFold/PHYRE2)、异源表达(大肠杆菌DH5α/pQE-80L系统)、催化位点定向突变(D495A/D564A)、FPLC纯化(HisTrap HP/Superdex 200柱)以及体外核酸酶活性检测(质粒剪切实验)。

EsAgo的基因组环境与进化特征
比较基因组分析显示25个Exiguobacterium属pAgo中14个与EsAgo序列相似度>90%，且普遍位于含TA系统、Wadjet、CRISPR-Cas等防御基因的基因组区域。系统发育分析表明EsAgo与常温工作的KmAgo(32%同源性)、CsAgo(36.3%)和IbAgo(32.2%)聚为一支，提示其可能具有中温活性。

EsAgo的体外核酸酶活性
纯化的EsAgo在Mn²⁺存在时可高效降解超螺旋质粒(pQE-80L)，5小时内完成近完全消化(97%超螺旋质粒被切割)。这种随机"切割"活性严格依赖二价阳离子，EDTA处理或催化位点突变(D495A/D564A)可显著减弱活性。值得注意的是，提供合成的5'-P ssDNA引导链后，非特异性切割被抑制，暗示引导链加载可能使EsAgo从随机模式切换为靶向模式。

引导依赖性DNA切割尝试
针对lacI基因设计的21nt引导DNA(产生5nt交错切口)与EsAgo孵育后，双引导复合物使线性化质粒增加5.67%，但未检测到预期的HindIII酶切片段。研究者推测37℃下dsDNA可及性不足或缺乏辅助解旋酶可能限制靶向效率，这与同类研究观察到的现象一致。

这项研究首次揭示了嗜碱外硫红杆菌EsAgo的双重作用模式：既可作为非特异性DNA切割酶，又可能通过引导链实现靶向干扰。其独特的性质为理解pAgo在细菌免疫中的功能提供了新视角——随机切割可能产生用于后续靶向的引导DNA，形成自我放大的防御循环。尽管引导依赖的特异性切割仍需进一步验证，但EsAgo在中温条件下展现的高效核酸酶活性，为开发新型可编程DNA操作工具提供了潜在候选。研究还提出有趣的可能性：EsAgo可能通过与邻近的DISARM系统drmA解旋酶协同，实现对dsDNA的识别和切割，这为后续研究指明了方向。

论文的局限性在于未能完全验证EsAgo在天然宿主中的免疫功能，且引导依赖切割的效率较低。未来研究可探索EsAgo的天然引导谱、与其它防御系统的协同机制，以及其切割特性在基因编辑中的应用潜力。这些发现不仅丰富了我们对原核生物免疫系统的认识，也为开发基于pAgo的生物技术工具奠定了基础。