基于CPMAS CryoProbe技术的微量淀粉样蛋白样品高质量13C检测结构解析新策略

为解决固态核磁共振(SSNMR)在微量生物样品分析中灵敏度不足的难题，研究人员利用CPMAS CryoProbe技术，在中等磁场(14.1 T)下成功对仅1.5 mg的RIPK3淀粉样纤维进行了13C检测的2D/3D谱图采集，实现了高分辨率结构解析。该研究为质量受限的生物大分子组装体研究提供了新方案。

　　

在结构生物学领域，固态核磁共振(SSNMR)是解析淀粉样纤维、膜蛋白等不溶性大分子组装体结构的利器。然而传统¹³C检测方法通常需要数毫克样品，这对难以获取的珍贵样本构成重大挑战。虽然近年发展的快速魔角旋转(魔法角自旋，MAS)和¹H检测技术将样品需求降至亚毫克级，但这些方法依赖超高速转子(160 kHz)和高场强磁体(>20 T)，且面临¹H化学位移分散度不足的固有缺陷。

针对这一技术瓶颈，研究人员创新性地将CPMAS CryoProbe技术应用于微量淀粉样蛋白研究。以坏死性凋亡关键蛋白RIPK3的RHIM结构域(387-518位氨基酸)为模型，该区域在免疫信号传导中会形成功能性淀粉样组装体。通过大肠杆菌表达系统获得均匀¹³C,¹⁵N标记的蛋白后，经尿素变性纯化和透析组装获得纤维样品，最终将仅1.5 mg的样品装入标准3.2 mm转子进行检测。

关键技术包括：1) 使用600 MHz(14.1 T)谱仪配备3.2 mm HCN CPMAS CryoProbe，在10 kHz MAS速率下检测；2) 采用非均匀采样(NUS)技术获取3D NCACX和NCOCX谱图；3) 通过交叉极化(CP)实现¹H-¹⁵N-¹³C信号传递；4) 利用Δ(¹³Cα-¹³Cβ)次级位移分析二级结构。

3.1 高质量¹³C检测谱图的获取
2D NCA谱图在12小时内即获得出色信噪比，其分辨率与常规满转子样品相当。3D实验通过NCACX和NCOCX谱图实现了骨架原子关联性分析，成功构建了残基间序列连接。特别值得注意的是，所有实验均在生理温度(37°C)下完成，这对研究功能性淀粉样蛋白的天然构象至关重要。

3.2 化学位移分析验证β-折叠结构
ΔCα-Cβ次级位移分析显示，RIPK3 RHIM核心区呈现典型的负值分布(-1至-4 ppm)，与已知的平行同向β-折叠结构高度吻合。该结果不仅验证了CryoProbe数据的可靠性，还首次在微量样品中补充了文献未报道的¹³Cβ位移数据。

这项研究突破了SSNMR技术对样品量的传统限制，证实CPMAS CryoProbe可在中等场强下实现微量(1-2 mg)样品的¹³C检测结构解析。相比¹H检测方案，该方法保留了¹³C化学位移的天然优势，且无需依赖超高速转子或超高场设备。对于RIPK3这类参与细胞坏死和免疫信号的功能性淀粉样蛋白，该技术为在近生理条件下研究其结构与功能关系开辟了新途径。更重要的是，这一策略可推广至其他难以获取的生物大分子组装体研究，为结构生物学领域提供了重要的方法学补充。