冷冻电镜解析尼帕病毒聚合酶结构及高通量RdRp检测技术推动抗NiV药物发现

本研究针对高致死率尼帕病毒(NiV)缺乏有效治疗药物的难题，通过冷冻电镜解析了马来西亚株和孟加拉株NiV聚合酶(L-P复合物)的全长及截短结构，首次发现PRNTase结构域中两个保守环与CD结构域的相互作用模式。研究团队开发了放射性标记RNA合成检测体系，证实了聚合酶的"反向引物"活性，并建立荧光(FAPA)和发光两种高通量筛选平台，测得NiV-B/M株聚合酶对RNA和NTP的Km值分别为5.6/3.3μM和22.79/20.9μM。这些突破为靶向L蛋白的抗病毒药物研发提供了关键结构基础和筛选工具。

　　

尼帕病毒(Nipah virus, NiV)作为亨尼帕病毒属的代表，自1998年马来西亚爆发以来，其致死率高达40-90%，孟加拉株(NiV-B)更表现出更强传染性和致病性。尽管单克隆抗体疗法展现出希望，但目前尚无获批的特效药物。这种非节段负链RNA病毒(NNS)的转录复制完全依赖其大蛋白(L)与磷酸化蛋白(P)形成的聚合酶复合物，其中L蛋白包含RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)、多聚核糖核苷酸转移酶(PRNTase)、连接域(CD)、甲基转移酶(MT)和C端结构域(CTD)五个功能域。由于需要在生物安全四级(BSL-4)实验室操作活病毒，针对L蛋白的高通量药物筛选面临重大挑战。

为突破这一瓶颈，来自诺华制药和埃默里大学的研究团队在《Nature Communications》发表了开创性研究。他们采用冷冻电镜单颗粒分析技术，解析了NiV马来西亚株(NiV-M)和孟加拉株(NiV-B)的全长及截短聚合酶结构，分辨率达到2.92-3.43?。研究建立了放射性标记的RNA合成检测体系，意外发现NiV聚合酶具有"反向引物"(back-priming)活性，能催化RNA模板的3'端延伸。更重要的是，团队开发出荧光(FAPA)和发光两种非放射性高通量检测平台，测得NiV-B/M株聚合酶对RNA和NTP的Km值分别为5.6/3.3μM和22.79/20.9μM，为抗病毒药物筛选奠定基础。

关键技术方法包括：利用杆状病毒表达系统制备全长和截短L-P复合物；通过冷冻电镜解析四种聚合酶结构；建立放射性标记RNA合成检测验证酶活性；开发碱性磷酸酶偶联荧光检测(FAPA)和焦磷酸偶联发光检测两种高通量筛选平台；采用AlphaFold2预测未解析结构域；通过质谱光散射分析复合物寡聚状态。

蛋白制备与NiV聚合酶检测体系开发
研究通过杆状病毒系统表达了NiV-M和NiV-B株的全长(FL)及截短(TR)L-P复合物，截短版本仅保留RdRp和PRNTase结构域。凝胶过滤色谱显示全长复合物出现两个活性峰，提示可能存在不同聚合状态。放射性标记实验证实，全长L-P能同时催化de novo合成(≤25nt)和反向引物产物(>25nt)，而截短版本仅产生反向引物产物。特别发现TrC25模板在仅有[α-³²P]-ATP时仍能合成26-28nt产物，证实了反向引物活性对模板二级结构的依赖性。

NiV聚合酶的整体结构特征
冷冻电镜结构显示，全长NiV-M L-P(2.92?)中成功解析了RdRp(7-970aa)和PRNTase(971-1446aa)结构域，以及四聚体P蛋白的部分结构。RdRp呈现经典的"手掌-手指-拇指"结构，催化中心831-GDN位于手掌亚结构域。PRNTase结构域包含关键的引物环(priming loop, S1266-P1290)和侵入环(intrusion loop, P1338-V1362)，后者含有保守的HR(组氨酸-精氨酸)基序负责mRNA加帽。比较NiV-M/B株截短结构发现，位于手掌亚结构域motif E的I890V突变可能通过改变疏水侧链影响聚合酶活性。

L与P蛋白的相互作用网络
全长结构中鉴定出六个L-P相互作用界面：界面1形成P1与L间的反平行β折叠(K385-E388∥M575-I578)；界面2通过Y389的"楔形"作用稳定P1/P2；界面3中P2延伸至RdRp模板进入通道；界面6则通过P-XD与RdRp形成稳定结合。这些相互作用主要分布在RNA模板进入侧和NTP进入侧，总界面面积达2870?²。值得注意的是，P蛋白四聚体中各单体在OD结构域高度保守，但延伸臂呈现显著构象差异。

RdRp-PRNTase与CD结构域的相互作用
在特定纯化条件下获得的全长NiV-M L-P-CD结构(2.99?)中，首次观察到CD结构域(1475-1757aa)与RdRp-PRNTase核心的相互作用。AlphaFold2预测模型显示，CD域的E1540和D1641分别与RdRp的K191、PRNTase的L973形成盐桥和氢键。这一界面在副粘病毒中高度保守，HPIV3中对应残基(L1483/N1584)也参与类似相互作用。通过比较HPIV5完整聚合酶结构，推测CD结合可能通过调节MT域位置来控制RNA模板进入。

研究结论与意义
这项工作通过结构生物学与生物化学方法的完美结合，揭示了NiV聚合酶的多个关键特征：首次发现全长L蛋白中CD结构域与RdRp-PRNTase核心的相互作用模式；阐明P蛋白四聚体各单体在结合L蛋白时的构象可塑性；证实C端结构域对维持引物环和侵入环稳定性的重要作用。开发的FAPA和发光检测平台(Z'>0.5)成功应用于工具化合物筛选(IC₅₀=0.8μM)，为抗NiV药物发现提供了可靠手段。特别值得注意的是，NiV-B株在motif E的I890V突变可能影响聚合酶活性，这为解释不同毒株的致病性差异提供了结构线索。这些发现不仅推动了对高致病性亨尼帕病毒复制机制的理解，更为靶向病毒聚合酶的抗感染药物设计奠定了坚实基础。