反义寡核苷酸探针技术揭示细菌核糖体组装过程中RNA折叠与蛋白质结合的动态机制

本研究针对细菌核糖体（RNP）快速组装机制这一结构生物学难题，创新性地采用反义寡核苷酸（ASO）探针技术，通过靶向抑制23S rRNA关键区域，成功捕获38种新型组装中间体。研究人员利用冷冻电镜（cryo-EM）解析发现：rRNA结构域可独立折叠后再进行域间对接，首次观察到非天然构象的III/VI结构域错配中间态，并鉴定出H32-H35等"RNA折叠子"（foldon）的模板指导组装路径。该研究不仅为大型RNP复合物组装机制研究建立新范式，更为靶向核糖体生物合成的抗生素开发提供新思路。

　　

核糖体作为生命活动的核心分子机器，其组装过程犹如精密的"分子折纸"艺术。细菌70S核糖体在短短2分钟内就能完成组装，这种惊人的效率背后隐藏着复杂的动态调控机制。传统研究主要通过调控核糖体蛋白（r-protein）或辅助因子表达来捕获组装中间体，但这种方法存在明显局限——无法精确控制扰动位点，更难以揭示占核糖体质量三分之二的rRNA的折叠奥秘。

美国斯克里普斯研究所（The Scripps Research Institute）的Kai Sheng、James R. Williamson团队在《Nature Communications》发表突破性研究。他们开创性地将反义寡核苷酸（ASO）探针技术引入大型核糖核蛋白复合体（RNP）研究，通过靶向阻断23S rRNA特定区域，成功"冻结"了核糖体组装过程中的关键瞬间。这项研究如同为核糖体组装过程安装了"分子监控器"，首次清晰记录了从初始折叠到最终组装的完整动态轨迹。

研究人员采用三项核心技术：1）建立包含20种肽核酸（PNA）的探针库，在体外共转录组装系统（iSAT）中进行高通量筛选；2）通过蔗糖梯度超离心分离中间体，结合冷冻电镜解析47个前50S亚基中间体结构（分辨率达5.27 ?）；3）开发新型接触依赖分析算法，构建包含数百个结构元件的组装路径图谱。

【ASO探针特异性阻断50S组装】
研究发现不同化学修饰的ASO抑制效果呈现DNA<sDNA<OMe<PNA<LNA的规律，其中肽核酸（PNA）能有效竞争性抑制天然RNA二级/三级结构的形成。通过生物素标记探针的定位验证，证实ASO精确结合靶向区域并导致相应电子密度缺失。

【47种中间体揭示组装层级】
冷冻电镜结构分析发现38种新型中间体，包括：

• J类：域I螺旋组装缺陷
• B-c类：首次观察到域III/VI独立折叠但错误对接的"懒8"构象
• G类：域II缺失的中间态
  这些发现证实rRNA结构域可先独立折叠，再通过uL13、uL22等"分子锚点"介导域间对接。

【RNA折叠子的模板指导组装】
对H32-H35区域的精细解析显示，RNA折叠遵循"模板指导"原则：已折叠区域形成特定位口袋，后续折叠子（如H32b、H33t）通过共价连接和三级相互作用逐步嵌入。这种机制类似拼图游戏，确保高效准确的组装路径。

【最小组装核心的进化保守性】
通过比较不同ASO抑制的中间体，鉴定出域I最小支架（H2-4,24/H7/H18-20），其结构在真核生物中高度保守。有趣的是，人类线粒体核糖体该区域被核编码蛋白替代，暗示特殊进化适应。

这项研究建立了ASO-cryoEM联用技术平台，为大型RNP组装研究开创了新范式。发现的RNA折叠子概念拓展了蛋白质折叠理论，为理解复杂生物大分子自组装提供普适性框架。更值得关注的是，研究鉴定的多个ASO靶点（如H1、H26）可作为新型抗生素开发靶标，为解决日益严峻的耐药性问题提供新思路。

研究还揭示了核糖体组装的质量控制机制——错误折叠的rRNA结构域（如RA20-B-c类）能被特定蛋白质锚定并稳定存在，这种"分子刹车"机制可能为细胞提供纠错机会。这些发现不仅深化了对生命基本过程的理解，也为人工设计调控RNP组装路径奠定了理论基础。