循环肿瘤DNA(ctDNA)检测技术的临床转化：从方法学突破到肿瘤精准诊疗

本文系统综述了循环肿瘤DNA(ctDNA)检测技术在肿瘤诊疗中的应用进展，重点解析了PCR与NGS(下一代测序)平台的技术优劣，探讨了肿瘤知情(tumor-informed)与肿瘤未知(agnostic)策略的临床适配性，并前瞻性评述了片段组学(fragmentomics)等新兴技术方向。研究为优化液体活检临床路径提供了关键方法学依据，对实现肿瘤早筛、微小残留病(MRD)监测及个体化治疗具有重要指导价值。

　　

在肿瘤诊疗领域，如何实现无创、动态的疾病监测始终是重大挑战。传统组织活检存在取样局限性和创伤性，而影像学检查对早期病变和微小残留病灶的敏感性不足。随着液体活检技术的兴起，循环肿瘤DNA(ctDNA)因其能反映肿瘤全基因组特征和实时动态变化，已成为最具潜力的生物标志物。然而，ctDNA在循环系统中的含量极低（尤其在早期肿瘤中仅占cfDNA的0.01%-1%），这对检测技术提出了极高要求。

比利时安特卫普大学医学遗传学中心(Center of Medical Genetics, University of Antwerp)联合法国巴黎西岱大学(Université de Paris)等机构的研究团队在《The Oncologist》发表综述，系统评估了当前ctDNA检测技术体系。研究通过对比PCR与NGS技术平台的性能参数，揭示了不同方法在灵敏度（最低检测限0.01% VAF）、通量和成本效益方面的权衡；创新性地提出了基于临床场景（早筛、MRD监测或耐药监测）的技术选择框架；特别强调了片段长度分析和甲基化检测等新型生物标志物的转化前景。

关键技术方法包括：1) 采用Safe-SeqS(安全测序系统)和CAPP-Seq(癌症个性化深度测序)等超灵敏NGS技术；2) 基于BEAMing(磁珠乳扩增)和微滴式数字PCR(ddPCR)的绝对定量方案；3) 整合白细胞测序的克隆造血(CH)过滤策略；4) 纳米孔测序实现实时甲基化检测；5) 机器学习驱动的片段组学分析。

主要研究结果：
ctDNA检测方法学比较
• PCR技术：qPCR(实时定量PCR)和dPCR(数字PCR)对已知突变检测灵敏度达0.1%，但仅限有限靶点。FDA批准的Cobas? EGFR检测可识别42种NSCLC相关突变。
• NGS技术：Guardant360 CDx覆盖324基因，能同时检测SNVs(单核苷酸变异)、CNAs(拷贝数变异)和融合基因，但成本较高。CAPP-Seq通过分子条形码将灵敏度提升至0.01%。
• 第三代测序：纳米孔平台可同步分析甲基化模式和片段特征，实现单次运行多组学检测。

临床策略优化
• 肿瘤知情(tumor-informed)策略：需先进行组织测序，对MRD检测特异性>95%，但耗时较长。
• 肿瘤未知(agnostic)策略：直接检测高频突变（如胰腺癌KRAS突变），适合快速筛查但可能漏检亚克隆。

干扰因素控制
克隆造血(CH)产生的体细胞突变可导致假阳性。平行测序白细胞可消除85%干扰，但增加50%成本。

新兴技术方向
• 片段组学：DELFI技术通过机器学习分析cfDNA断裂模式，对I/II期肺癌检测灵敏度达91%。
• 酶促甲基化测序：TAPS(四氧化三铁辅助焦磷酸测序)避免亚硫酸氢盐导致的DNA降解，更适合微量样本。

结论与展望：
该研究确立了ctDNA检测技术选择的"三步法"原则：1) 根据临床需求（如早筛需高灵敏度，治疗监测需动态范围）选择平台；2) 结合肿瘤分子特征（突变负荷、表观遗传改变）优化检测方案；3) 通过白细胞测序或生物信息学过滤降低CH干扰。特别值得注意的是，整合片段长度（167bp vs 143bp峰型）与甲基化特征的多参数模型，可将早期结直肠癌检出率从单突变检测的48%提升至89%。随着EM-seq(酶促甲基化测序)等新技术成熟，未来液体活检有望实现<100美元的单次全基因组表观遗传分析，这将彻底改变肿瘤筛查和疗效监测范式。