新型靶向LC-MS/MS方法的发展用于心脏淀粉样变性的分型

《Analytica Chimica Acta》：Development of a novel targeted LC-MS/MS Methods for the typing of cardiac amyloidosis

心脏淀粉样osis（CA）诊断新方法采用靶向半定量蛋白质组学结合三重四极杆质谱（LC-MS/MS），显著提高分型准确性和可行性（AUC达0.964-0.999），成功区分ATTR、AL-κ和AL-λ亚型，弥补传统IHC灵敏度不足和LMD-MS成本过高缺陷。

　　

摘要

背景

心脏淀粉样变性（CA）的治疗和预后在很大程度上取决于对淀粉样蛋白类型的准确识别。组织病理学方法是常用的方法，但往往无法得出明确的结果。基于非靶向蛋白质组学的激光微切割质谱技术在CA诊断中的应用逐渐受到认可，但这种方法成本高昂、耗时较长，且仍处于科学研究的早期阶段。本研究旨在建立一种基于靶向半定量蛋白质组学的新分型方法，以弥补现有方法的不足。

结果

分析了52例CA患者和52例肥厚型心肌病（HCM）患者的福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）心肌组织样本。采用三重四极杆质谱仪结合激光微切割质谱技术（LMD-MS）作为参考标准，开发了一种半定量分型方法。

共分析了52种肽。关键的淀粉样相关蛋白（AAPs）——载脂蛋白A-IV（apo A-IV）、载脂蛋白E（apo E）和血清淀粉样蛋白P组分（SAP）——显示出较高的诊断准确性，其AUC值分别为0.964、0.999和0.923。通过调整微切割和肽峰面积后的标准化分数（NS）对转甲状腺素蛋白（TTR）、免疫球蛋白轻链-κ（IGL-κ）和IGL-λ进行了半定量分析。NS_TTR的临界值为0.066，可用于区分转甲状腺素蛋白淀粉样变性（ATTR）；NS_λ-NS_κ的比值可用于区分AL-κ（≤-0.04758）和AL-λ（>0.00999）。该方法成功识别出15例ATTR、10例AL-κ、21例AL-λ以及混合亚型，结果与LMD-MS的结果一致。相比之下，免疫组化仅准确分出了14例，大多数结果不明确。

意义

这种靶向半定量质谱方法与非靶向LMD-MS分型方法具有一致性，其准确性高于免疫组化（100% vs 30.8%），同时弥补了非靶向蛋白质组学的局限性。它为常规临床实验室提供了一种实用的心脏淀粉样变性分型方法，未来可能有助于识别罕见的淀粉样变性亚型。

引言

心脏淀粉样变性（CA）是一种罕见疾病，其特征是蛋白质错误折叠并聚集形成不溶性的纤维沉积物，这些沉积物存在于心肌细胞周围的细胞外空间[1]或血管周围空间以及心肌内的小冠状血管中[2]。这一病理过程会导致心脏壁逐渐增厚、舒张功能障碍[3]和微血管冠状动脉功能障碍[4]。其症状较为隐匿，容易被误诊，因此近年来人们对CA的关注度逐渐增加。

目前，已知约有42种蛋白质会在人体组织中形成淀粉样沉积物[5]，其中11种会在心脏组织中沉积[6],[7]。转甲状腺素蛋白相关淀粉样变性（ATTR）和轻链淀粉样变性（AL）是CA的主要亚型。AL的毒性特别强，6个月内的死亡率超过50%[8],[9]，而野生型转甲状腺素蛋白淀粉样变性（ATTRwt）的中位生存期为43至57个月[10]。AL的治疗通常包括化疗或干细胞移植，而ATTR则通常采用肝脏移植或肝-心脏联合移植。及时诊断对治疗效果有显著影响；延误诊断会导致淀粉样蛋白负荷增加，从而降低治疗效果。

根据Christen等人的研究[11]，淀粉样蛋白负荷较低且对化疗反应良好的AL患者生存率较高，而延误诊断或误诊可能导致淀粉样蛋白负荷增加，治疗效果变差。近年来，针对ATTR的靶向治疗药物取得了进展[12],[13],[14],[15]。准确识别形成纤维的特定蛋白质对于制定治疗方案和避免其他类型的淀粉样变性患者接受不必要的、可能有害的化疗至关重要。

组织病理学或激光微切割结合质谱技术（LMD-MS）主要用于CA的分型。传统方法首先使用刚果红染色，然后通过免疫组化（IHC）或免疫荧光（IF）进行分型，但这些方法无法识别罕见亚型，且由于血清污染导致的背景染色较高、刚果红固定过程中蛋白质交联丧失以及缺乏针对各种淀粉样蛋白亚型的特异性抗体，可能会产生不确定的分型结果。相比之下，LMD-MS通过分离刚果红阳性区域进行精确的蛋白质分析，并与数据库进行比对，从而提高了分型的特异性，克服了传统方法的局限性。

这种方法论的转变始于梅奥诊所对神经组织免疫球蛋白的分类研究，被认为是传统金标准技术的替代方案[16]。Vrana JA的研究[17]表明，基于IHC的淀粉样亚型分型测试的失败率为58%，原因是抗体-抗原反应不可靠；而LMD-MS的失败率仅为2%。研究表明，LMD-MS在可靠性方面优于IHC，能够降低失败率并改善患者预后，同时优化医疗成本。然而，由于仪器复杂性、生物信息学专业要求及监管限制，其广泛应用仍面临挑战。

为弥补上述不足，本研究旨在建立一种使用靶向LC-MS/MS进行CA诊断和分类的新方法。这种方法有望提高临床实验室的可行性，可能改变CA的诊断和管理方式。

方法部分

心脏淀粉样变性（CA）是一种罕见疾病，其特征是蛋白质错误折叠并聚集形成不溶性的纤维沉积物，这些沉积物存在于心肌细胞周围的细胞外空间[1]或血管周围空间以及心肌内的小冠状血管中[2]。这一病理过程会导致心脏壁逐渐增厚、舒张功能障碍[3]和微血管冠状动脉功能障碍[4]。由于其症状较为隐匿，容易与其他疾病混淆，导致误诊率较高，因此近年来人们对CA的关注度不断提高。

目前，已发现约42种蛋白质会在人体组织中形成淀粉样沉积物[5]，其中11种会在心脏组织中沉积[6],[7]。转甲状腺素蛋白相关淀粉样变性（ATTR）和轻链淀粉样变性（AL）是CA的主要亚型。AL的毒性尤其强，6个月内的死亡率超过50%[8],[9]，而野生型转甲状腺素蛋白淀粉样变性（ATTRwt）的中位生存期为43至57个月[10]。AL的治疗通常包括化疗或干细胞移植，而ATTR则通常采用肝脏移植或肝-心脏联合移植。及时诊断对治疗效果有显著影响；延误诊断会导致淀粉样蛋白负荷增加，从而降低治疗效果。

根据Christen等人的研究[11]，淀粉样蛋白负荷较低且对化疗反应良好的AL患者生存率较高，而延误诊断或误诊可能导致淀粉样蛋白负荷增加，治疗效果变差。最近，针对ATTR的靶向治疗药物取得了进展[12],[13],[14],[15]。准确识别形成纤维的特定蛋白质对于制定个性化治疗方案和避免其他类型的淀粉样变性患者接受不必要的化疗至关重要。

组织病理学或激光微切割结合质谱技术（LMD-MS）是主要的CA分型方法。传统方法首先使用刚果红染色，然后通过免疫组化（IHC）或免疫荧光（IF）进行分型，但这些方法无法识别罕见亚型，且可能因血清污染导致背景染色较高、刚果红固定过程中蛋白质交联丧失以及缺乏针对所有不同淀粉样蛋白亚型的特异性抗体而产生不确定的分型结果。相比之下，LMD-MS通过分离刚果红阳性区域进行精确的蛋白质分析，并与数据库进行比对，克服了传统方法的局限性。

该方法论的转变始于梅奥诊所对神经组织免疫球蛋白的分类研究，被认为是传统金标准技术的替代方案[16]。Vrana JA的研究[17]表明，基于IHC的淀粉样亚型分型测试的失败率为58%，原因是抗体-抗原反应不可靠；而LMD-MS的失败率仅为2%。研究表明，LMD-MS在可靠性方面优于IHC，能够降低失败率并改善患者预后，同时优化医疗成本。然而，其广泛应用受到仪器复杂性、生物信息学专业要求及监管限制的阻碍。

为弥补上述不足，本研究旨在建立一种使用靶向LC-MS/MS进行CA诊断和分类的新方法。这种方法有望提高临床实验室的可行性，可能改变CA的诊断和管理方式。

仪器设备

Citrine? Triple Quad?系统和ZenoTOF? 7600系统（AB SCIEX，新加坡）；LMD7（Leica Microsystems，德国韦茨拉尔）；M-class Micro Acquity UPLC系统（Waters，美国马萨诸塞州米尔福德）；ThermoMixer? C（Eppendorf，美国纽约州布林克曼仪器公司）；SpeedVac（Labconco，美国）；超声波清洗机UC-9000（SZLangee，中国深圳）；Sorvall Legend Micro 17离心机（Thermo Scientific，德国）。自动免疫组化染色仪器（BenchMark ULTRA，罗氏公司）

结果

图1显示了Citrine? Triple Quad?系统上19种蛋白质的标准肽段的色谱图。

本研究涉及的淀粉样蛋白亚型包括AL-κ、AL-λ和ATTR。基于对临床样本的全面评估，表1中标记*的肽被选用于计算蛋白质丰度和响应强度，从而确定鸟枪法蛋白质组学和靶向蛋白质组学的分型结果。

讨论

检测单克隆免疫球蛋白对于诊断AL-CA至关重要。识别方法包括血清游离轻链（FLC）检测和血清/尿液免疫固定电泳（IFE）。所有三项检测均阴性的患者通常可以排除AL-CA。然而，阳性结果并不能确证AL-CA，因为65岁及以上的个体中有多达3%的人患有原因不明的单克隆丙种球蛋白病（MGUS）。同时患有MGUS的老年ATTR-CA患者...

结论

基于靶向质谱和半定量蛋白质分析，本研究建立了一种创新的心脏淀粉样变性分型方法，可用于常规临床实验室。然而，该方法仍存在以下局限性：（1）靶向蛋白质组学方法无法检测免疫球蛋白轻链克隆型肽（只能通过非靶向蛋白质组学检测）；（2）本研究为回顾性研究，纳入的样本来自2018年及以后，早期的IHC结果依赖于手动分析...

CRediT作者贡献声明

李莉：资源准备、方法学设计。刘瑞晨：初稿撰写、方法学设计、数据分析。王凯娟：初稿撰写、验证、方法学设计、数据分析。高晓静：验证。丛红英：验证。赵向龙：撰写、审稿与编辑、方法学设计、数据分析。段雪静：方法学设计。周洲：项目监督、行政管理、调查。尹坤伦：资源协调。高张伟：验证

作者的利益冲突声明

作者声明没有需要披露的利益冲突。

研究资助

本研究得到了中国医学科学院医学科学创新基金（CIFMS 2023-I2M-C&T-B-064）的支持。

利益冲突声明

? 作者声明没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。