DODAB-ODN脂质复合物结构对寡核苷酸浓度的依赖性：多技术实验研究揭示基因递送载体设计新见解

为解决基因治疗中非病毒载体效率低下的问题，研究人员通过动态光散射(DLS)、Zeta电位、小角X射线散射(SAXS)、差示扫描量热法(DSC)和荧光光谱等技术，系统研究了阳离子脂质DODAB与寡核苷酸(ODN)在不同浓度下形成的脂质复合物(lipoplex)结构变化。研究发现ODN浓度梯度(<0.050、0.050-0.075、≥0.075)显著影响复合物的胶体稳定性、多层膜结构形成及表面脱水状态，为优化基因载体设计提供了重要理论依据。

　　

基因治疗作为现代医学的革命性策略，其核心挑战是如何安全高效地将遗传物质递送至靶细胞。虽然病毒载体转染效率高，但免疫原性和插入突变风险促使科学界探索非病毒替代方案。其中，阳离子脂质体因其与带负电的核酸自组装特性备受关注，但脂质-核酸复合物的结构不稳定性严重制约其临床应用。这一领域的关键科学问题在于：如何精确调控脂质-核酸相互作用以平衡载体稳定性和转染效率？

针对这一挑战，国内研究团队在《Biochemistry and Biophysics Reports》发表的研究中，选择典型阳离子脂质双十八烷基二甲基溴化铵(Dioctadecyldimethylammonium bromide, DODAB)和模型寡核苷酸5′-AAAAAAAAAA-3′(ODN)作为研究对象。通过多尺度表征技术，首次系统揭示了ODN浓度梯度对脂质复合物结构的调控规律，为理性设计基因载体提供了分子水平的理论支撑。

研究采用动态光散射(DLS)监测粒径变化，Zeta电位分析表面电荷特性，小角X射线散射(SAXS)解析纳米结构，差示扫描量热法(DSC)表征热力学行为，并结合荧光探针Laurdan的时间分辨荧光技术，动态追踪了脂质膜表面微环境变化。所有实验均在10 mM HEPES缓冲液(pH 7.4)中完成，温度分别控制在DODAB的凝胶相(30°C)和流体相(60°C)进行对比研究。

3.1 胶体稳定性
研究发现ODN浓度呈现三阶段效应：低浓度区间([ODN]/[DODAB]<0.050)时，zeta电位从+50 mV降至+38 mV，粒径从115 nm增至420 nm，SAXS显示开始形成多层结构；临界浓度(0.050-0.075)引发电荷中和导致胶体失稳；高浓度(≥0.075)时表面电位反转至-44 mV，恢复胶体稳定性且粒径回归初始值。这种"电荷反转"现象与CT DNA等大分子核酸的报道一致，但首次在短链ODN体系中观察到。

3.2 ODN诱导DODAB挤出囊泡融合
SAXS数据揭示：原始挤出囊泡为单层结构，添加0.012 mM ODN后出现d=4.5 nm(30°C)和4.8 nm(60°C)的布拉格峰，证实形成多层囊泡。高浓度ODN(0.100 mM)显著增强布拉格峰强度但不改变层间距，表明多层囊泡数量增加而非层数变化。这与DLS显示的粒径恢复现象共同说明，高浓度ODN促使形成小而多的多层囊泡群体。

3.3 ODN对DODAB囊泡的热效应
DSC热谱图显示典型浓度依赖性：低浓度时出现双峰(46.5°C和49°C)，反映ODN富集区与贫乏区共存；中浓度(0.050)仅存49°C单峰，对应电荷中和状态；高浓度时相变温度进一步升至53°C，且呈现复杂多峰特征。这种热稳定性提升与文献报道的ODN诱导脂质分子紧密排列一致。

3.4 高浓度ODN导致表面堆积和/或脱水
荧光探针Laurdan的发射光谱在高浓度ODN下蓝移11 nm(凝胶相)和4 nm(流体相)，荧光寿命从3.82 ns(凝胶相)和2.31 ns(流体相)显著延长。结合早期电子自旋共振(ESR)数据，证实ODN在凝胶相中全面增加膜有序性，而在流体相呈现表面脱水/堆积与链段流动性增加并存的特殊现象。

这项研究通过多技术联用，首次绘制出DODAB-ODN体系的完整"相图"：低浓度形成带正电的多层囊泡，中浓度发生电荷中和导致聚集，高浓度产生带负电的稳定多层囊泡。特别重要的是，发现ODN不仅能通过静电作用调控载体表面性质，还可通过改变脂质分子排列影响载体热稳定性和内部结构。这些发现为基因载体的精确设计提供了新思路——通过调控核酸/脂质比例，可定向获得具有特定表面电荷、结构特性和释放特性的复合物。该研究建立的系统表征方法，也为其他脂质-核酸体系的机制研究提供了范式。

论文的创新性在于：使用挤出囊泡替代传统超声制备的囊泡，更接近实际应用场景；选择短链ODN而非长链DNA，更好模拟siRNA等现代基因药物；首次将Laurdan荧光技术应用于脂质复合物表面微环境研究。这些发现对开发新型疫苗佐剂和基因药物递送系统具有重要指导价值，特别是为平衡载体稳定性和内涵体逃逸效率这一关键问题提供了实验依据。未来研究可进一步探索这种浓度依赖性结构变化与细胞摄取、内体逃逸等生物学行为的相关性。