基于重组凝集素功能化纳米多孔金生物界面的新型超灵敏阻抗生物传感器用于快速检测铜绿假单胞菌

研究人员针对铜绿假单胞菌快速检测需求，开发了一种基于重组凝集素功能化纳米多孔金界面的超灵敏阻抗生物传感器。该研究通过合成生物学技术构建高亲和力生物受体，实现了32 Ct当量(0.5 fM)的检测限，较传统比色生物传感器灵敏度提高10-100倍。临床验证显示100%的敏感性和特异性，与RT-qPCR结果高度相关(r=0.945)，为病原体检测提供了新型高效平台。

　　

诺如病毒(NoVs)是全球急性病毒性胃肠炎的主要病原体，每年导致约7亿病例和5万儿童死亡，尤其在医疗资源匮乏地区造成严重负担。传统检测方法如RT-PCR虽灵敏特异，但耗时且需要专业设备；ELISA虽广泛应用但通量低；快速免疫层析法则灵敏度不足。这些技术瓶颈促使科学家们寻求更高效、更便捷的检测方案。

在此背景下，来自西班牙的研究团队在《Biosensors and Bioelectronics》发表了一项突破性研究。他们巧妙地将合成生物学与生物传感技术相结合，开发出一种基于DVD平台的光电生物传感器。该系统利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统生产的诺如病毒样颗粒(NoV-LPs)作为精确参考纳米材料，并通过噬菌体展示技术生成高亲和力单链可变区片段(scFv)抗体作为生物受体，实现了对临床粪便样本中人类诺如病毒(HuNoV)的快速、高灵敏度定量检测。

研究采用了多项关键技术：通过杆状病毒表达系统(BEVS)生产GII.4 Sydney 2012型NoV-LPs；利用噬菌体展示技术筛选特异性scFv抗体；建立基于微阵列的竞争性和夹心免疫分析方法；开发可同时分析8个样本的微型DVD光电检测系统。研究使用的20份人类粪便样本来自瓦伦西亚大学临床医院5岁以下儿童。

在病毒样颗粒表征方面，研究通过透射电镜和冷冻电镜证实制备的NoV-LPs具有38 nm直径，与天然病毒大小一致。有趣的是，这些颗粒显示出T=4二十面体对称性，由240个VP1拷贝组成，比典型T=3结构更稳定。SDS-PAGE分析显示58 kDa蛋白条带呈现双联模式，与先前研究一致。这些特性使NoV-LPs成为理想的生物传感参考材料。

在抗体开发方面，研究人员通过噬菌体展示技术获得了针对NoV-LPs的特异性scFv。电泳显示V_L和V_H基因片段各约400 bp，连接后形成800 bp的scFv构建体。Western blot分析在25 kDa处显示清晰条带，每升昆虫细胞培养物可获得4.0 mg scFv。生物层干涉实验测得scFv与NoV-LPs的解离常数(K_D)为1.33×10^-12 M，表明具有超高亲和力。

在分析方法优化中，研究比较了竞争法和夹心法两种免疫测定形式。夹心法表现出更优异的性能，检测限达0.5 fM(约300病毒颗粒/μL)，定量范围1.0 fM至10 pM，重复性为11%。竞争法则达到10 fM的灵敏度。两种方法可在同一平台上并行运行，大大扩展了应用范围。

在临床样本验证中，该生物传感器与RT-qPCR结果高度一致(r=0.945)，对20份粪便样本的检测显示出100%的临床敏感性和特异性。值得注意的是，它能准确检测Ct值10-25范围内的样本，这正是诊断和传染性评估的关键区间。选择性实验证实其对GII.4型诺如病毒的特异性识别能力。

这项研究的意义在于：首先，建立了NoV-LPs作为标准化参考材料的新用途，为蛋白和DNA检测方法的标准化提供了桥梁；其次，展示了合成生物学在诊断生物传感器开发中的强大潜力，通过整合噬菌体展示、BEVS和细菌转化等技术，实现了高效、可扩展的蛋白质生产；最后，开发的DVD平台具有成本低、操作简单、检测快速(45分钟)等优势，特别适合资源有限地区的推广应用。该技术不仅为诺如病毒检测提供了新方案，其模块化设计也为其他病原体检测提供了可借鉴的技术路线。