工程化改造与实验室进化：构建乳糖利用型恶臭假单胞菌KT2440及其在乳清资源化中的应用

针对乳制品工业废水中乳糖污染难题，研究人员通过代谢工程和实验室进化策略，成功构建了能高效利用乳糖的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT2440Gal工程菌株。该研究整合了β-半乳糖苷酶基因lacZ、半乳糖Leloir途径基因galETKM及乳糖通透酶基因lacY，并通过逆向遗传学验证关键突变，为乳清废水的生物处理提供了新方案。

　　

乳制品工业的繁荣背后隐藏着一个甜蜜的负担——每年数千万吨的乳清废水。这种含有66-77%乳糖的副产品，其化学需氧量(COD)高达80 g/L，是城市污水的100倍。传统处理方法难以有效解决这一环境难题，而恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT2440虽具备卓越的环境适应性和代谢潜力，却无法天然利用乳糖这一关键碳源。

来自爱沙尼亚研究团队的研究人员开展了一项突破性研究，通过"基因剪刀+进化加速器"的策略，成功赋予KT2440乳糖代谢能力。研究团队首先引入大肠杆菌的Leloir途径基因簇galETKM（编码半乳糖激酶GalK、半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶GalT、UDP-半乳糖-4-差向异构酶GalE和变旋酶GalM）与乳糖通透酶基因lacY，同时通过质粒表达β-半乳糖苷酶LacZ。随后通过实验室进化筛选获得三株乳糖高效利用突变体，并利用逆向遗传学揭示了gltR和PP_2046基因突变的关键作用。该成果发表于《Journal of Biotechnology》，为乳清废水的微生物转化提供了全新工具。

关键技术包括：1) 多基因染色体整合技术；2) 最小培养基定向进化筛选；3) 全基因组测序与突变定位；4) 生长动力学与碳源共利用分析；5) 蛋白质结构同源建模。

【研究结果】

1. 菌株构建：成功将galETKM操纵子与lacY整合至KT2440基因组rrn位点，获得基础工程菌KT2440Gal。
2. 实验室进化：在乳糖最小培养基中经150代进化，获得生长速率提升2.3倍的Lac⁺突变体。
3. 突变分析：全基因组测序发现gltR（调控谷氨酸代谢）和PP_2046（假定转运蛋白）基因的关键突变。
4. 逆向验证：回补实验证实gltR突变使乳糖利用率提升37%，PP_2046突变则影响碳源切换效率。
5. 共代谢特性：突变体可同步利用葡萄糖和乳糖，且对半乳糖抑制效应具有抗性。

【结论与意义】
该研究首次实现了恶臭假单胞菌对乳糖的高效利用，突破了该菌株仅能代谢单糖的局限。通过组合代谢工程与实验室进化，不仅解决了半乳糖代谢毒性问题，还发现了新的代谢调控靶点。工程菌对混合碳源的共利用能力，使其特别适合处理成分复杂的乳清废水。这一成果为建立"乳制品废物-微生物转化-高值化学品"的循环经济模式提供了关键技术支撑，有望减少乳业83%的污染排放。研究揭示的gltR全局调控作用，为理解细菌碳源代谢网络提供了新视角。