单体II类螯合酶Mch4的发现与表征：揭示四组氨酸活性位点在进化过程中的关键作用

研究人员针对II类螯合酶从同源二聚体祖先型向单体后代型进化的中间态缺失问题，通过生物信息学筛选和实验验证，首次发现并表征了具有四组氨酸活性位点的单体螯合酶Mch4。该研究证实Mch4能催化Fe2+插入sirohydrochlorin（SHC），并保留Ni2+/Co2+螯合活性，为理解II类螯合酶进化路径提供了关键分子证据。

　　

在生命演化的长河中，金属-四吡咯复合物作为关键辅因子，参与了从光合作用到呼吸链的多种核心生理过程。这类复合物的形成依赖于螯合酶的精准催化，其中II类螯合酶因其简单的ATP非依赖性机制，成为研究金属离子插入机制的理想模型。然而，长期以来存在一个悬而未决的进化谜题：具有同源二聚体结构的祖先型螯合酶（如CfbA）如何演化为单体结构的后代型（如SirB、PpfC）？这两种类型虽具有相似的折叠结构，但活性位点组氨酸数量差异显著——前者含四个组氨酸，后者仅保留一至两个。这一现象催生了"基因复制融合"假说，但自然界中始终缺乏直接证明该假说的"进化中间态"螯合酶证据。

为填补这一空白，研究人员展开了一项跨学科研究。通过InterPro数据库筛选20,000条CbiX样家族序列，结合AlphaFold结构预测，首次鉴定出43个具有四组氨酸活性位点的单体螯合酶，命名为Mch4（Monomeric chelatase with four histidines）。选择Methanobrevibacter ruminantium（Mr）和Methanosphaera stadtmanae（Ms）的Mch4作为代表，研究人员通过基因互补系统、体外活性测定和计算模拟等多维度分析，揭示了这类"进化活化石"的独特性质。

研究采用的关键技术包括：1）基于InterPro和AlphaFold数据库的大规模生物信息学筛选；2）建立E. coli ΔcysG、ΔpgdH1和ΔppfC三种基因互补系统验证体内功能；3）镍/钴/铁螯合酶活性光谱分析；4）分子对接模拟预测底物结合模式；5）最大似然法构建系统发育树。这些方法的综合运用，使研究首次在原子层面捕捉到II类螯合酶进化过程中的关键"中间态"特征。

3.1 进化中间态II类螯合酶的发现
通过结构比对发现，Mr和Ms Mch4的AlphaFold模型与Mj CfbA晶体结构主链RMSD值分别为1.224?和1.041?，证实其整体折叠高度保守。活性位点分析显示，Mch4完美保留了CfbA特征性的四组氨酸配置，但通过柔性连接区（如Mr Mch4的EDSKLDDDAKTA）实现了单体化转型，这为"基因复制融合"假说提供了结构证据。

3.2 SHC铁螯合酶的体内功能
在E. coli ΔcysG互补实验中，引入Mb sirC与Mr/Ms mch4的菌株在无L-半胱氨酸培养基中恢复生长，证明Mch4具有将Fe²⁺插入SHC生成siroheme的生理功能，活性与阳性对照Ec cysG相当。

3.3 CPIII和PPIX底物特异性分析
通过重建B. subtilis CPD途径和E. coli PPD途径发现，Mch4不能互补ΔpgdH1和ΔppfC菌株的生长缺陷，表明其体内不能利用coproporphyrin III（CPIII）和protoporphyrin IX（PPIX）。这一发现与后续体外实验互为印证。

3.4 多金属螯合活性表征
体外实验揭示Mch4具有广谱金属适应性：对SHC的催化效率呈现Fe²⁺（0.10 min^-1）> Co²⁺（0.058/0.015 min^-1）> Ni²⁺（0.0052/0.00080 min^-1）的梯度差异。值得注意的是，尽管镍螯合活性较Mj CfbA降低约100倍，但这一"残留活性"暗示了从F430生物合成酶向其他金属螯合酶的进化轨迹。

3.5 底物选择性的结构基础
分子对接显示，SHC与Mch4形成12-13个极性相互作用（如Mr Mch4-Ser17/18/169），远多于CPIII（7-9个）和PPIX（3-5个）。更重要的是，Mch4缺乏CpfC/PpfC特有的"lip"区域，导致其无法有效结合疏水性更强的CPIII/PPIX，这从结构上解释了底物特异性。

3.7 系统发育分析
构建的进化树将43个Mch4集中分布于古菌分支（clade A），与含His-rich区域的CfbA（clade B）相邻。对1984个Mch3的分析发现，794个在位置2、1189个在位置4发生His→Phe/Ile/Leu等疏水氨基酸替换，这种定向突变可能为适应不同金属/四吡咯底物提供了进化选择压力。

这项研究首次证实自然界存在兼具祖先型活性位点与后代型单体结构的II类螯合酶Mch4，为理解该类酶的分子进化提供了关键拼图。其保留的镍螯合活性如同"分子化石"，记录了从厌氧古菌（依赖Ni-SHC的F430）向需氧生物（依赖Fe-PPIX的血红素）的进化过渡。特别值得注意的是，Mch4在甲烷菌中的分布模式暗示其可能参与多种金属代谢途径：在M. ruminantium中可能主要作为F430合成酶，而在M. stadtmanae中可能同时参与钴胺素和siroheme合成。该发现不仅完善了金属螯合酶的分类框架，也为设计新型生物催化剂提供了进化模板——通过理性改造活性位点组氨酸配置，或可开发具有特定金属选择性的工程酶。

研究还提出了引人深思的进化悖论：为何在多数后代酶中，四个组氨酸被替换为疏水残基？可能的解释包括：1）增强对疏水底物（如PPIX）的适应性；2）提高蛋白质稳定性；3）响应地球环境从富镍厌氧向贫镍需氧的转变。这些发现为"镍匮乏假说"提供了酶学证据，暗示生物大分子进化与地质环境变迁存在深刻关联。未来对更多Mch3的功能表征，或将揭示II类螯合酶适应不同生态位的精确分子机制。