抗逆转录病毒与CRISPR联合治疗中HIV-1反弹病毒的独特分子特征解析

本研究针对HIV-1感染者经长效抗逆转录病毒疗法(LA-ART)和CRISPR-Cas9联合治疗后出现的病毒反弹现象，通过Sanger测序和二代测序(NGS)技术，系统分析了反弹病毒的gag、pol和env基因突变特征。研究发现env区域呈现最高变异率，且突变主要源于LA-ART的选择压力而非CRISPR靶向编辑。该成果为优化HIV联合治疗策略提供了关键分子依据，发表于《Communications Biology》。

　　

在人类与HIV-1长达四十余年的斗争中，抗逆转录病毒治疗(ART)虽能控制病毒复制，却无法根治感染。潜伏病毒库的存在和耐药突变(DRAMs)的产生，使得治疗中断后病毒反弹成为重大挑战。近年来，CRISPR-Cas9基因编辑技术为清除整合的前病毒DNA带来希望，但联合LA-ART与CRISPR治疗后，仍有超50%的人源化小鼠出现病毒反弹。这一现象背后的分子机制亟待阐明。

美国内布拉斯加大学医学中心（University of Nebraska Medical Center）的研究团队在《Communications Biology》发表重要成果。研究人员采用包含纳米化多替拉韦(dolutegravir)、拉米夫定(3TC)、阿巴卡韦(ABC)和利匹韦林(RPV)的LA-ART方案，联合靶向HIV-1 LTR-gag的CRISPR-Cas9，对HIV-1_NL4-3和HIV-1_ADA感染的人源化小鼠进行序贯治疗。通过单步逆转录PCR避免自发突变，结合Sanger测序和Illumina MiSeq NGS技术，系统分析了血浆病毒RNA的gag、pol和env基因变异特征。

关键技术方法
研究采用NSG人源化小鼠模型，通过腹腔接种HIV-1病毒建立感染。LA-ART包含纳米化NRPV及髓鞘化NMDTG/NM3TC/NMABC，肌注给药6周后，静脉注射AAV9递送的CRISPR-Cas9。使用Qiagen MinElute病毒试剂盒提取血浆病毒RNA，通过高灵敏度的一步法RT-PCR扩增6.7kb病毒基因组片段，采用Sanger测序和Illumina MiSeq平台分别进行低频突变检测，利用Hypermut 2.0和Stanford HIVdb算法分析耐药突变。

研究结果

HIV-1变异分析
env基因在治疗后表现出最高变异频率（图2A-C），其V1/V2区变异与临床患者数据一致。pol区突变频率与血浆病毒载量呈显著负相关(r=-0.5879, p=0.008)，提示该区域变异可能影响病毒适应性。

纵向变异分析
对5只小鼠的env基因进行纵向追踪（图3A-C），发现62%的终点突变产生于LA-ART治疗期间，证实ART选择压力是驱动病毒进化的主要因素。

耐药突变检测
Sanger测序检出整合酶附属突变V151I（表2）；NGS在20%阈值下检出NNRTI主要突变E138K（降低利匹韦林敏感性3倍）和INSTI突变R263K（表3）。值得注意的是，41.6%的HIV-1_NL4-3感染鼠和100%的HIV-1_ADA感染鼠携带至少一种DRAM（图4B）。

新突变发现
NGS在5%阈值下发现RT区新型突变簇（图6A-E），包括LA-ART组特有的E29G/Q151R，这些未收录于斯坦福耐药数据库的突变可能与病毒逃逸相关。

CRISPR靶向分析
在gRNA靶向的LTR-gag区未检测到CRISPR相关突变（补充图10A），但双治疗组40%的小鼠出现CD4结合环区甘氨酸→精氨酸突变（补充图10B），提示联合治疗可能影响病毒侵入机制。

结论与意义
该研究首次揭示了LA-ART/CRISPR联合治疗后HIV-1反弹的分子特征：env基因的高变异性、pol区突变的临床相关性、以及LA-ART（而非CRISPR）驱动的耐药突变优势。发现的新型突变位点为优化联合治疗方案提供了靶点，而CRISPR靶向区域的高度保守性则支持其作为治愈策略的潜力。这些发现为理解治疗压力下的病毒进化提供了重要范式，对临床制定个体化HIV治疗策略具有指导价值。