基于DIA技术的山羊妊娠期血清蛋白质组学：生物标志物与机制

《Research in Veterinary Science》：DIA-based serum proteomics in goat pregnancy: biomarkers & mechanisms

本研究采用DIA技术分析妊娠期山羊血清蛋白组学特征，鉴定19,740个蛋白并筛选出2201个差异蛋白（FC≥1.5或≤0.66，P<0.05），富集于免疫应答、代谢、细胞增殖等通路，其中VKORC1L1、PSTPIP2和CD40LG在早期妊娠持续上调，揭示其与胚胎发育和免疫调节相关，为山羊妊娠维持机制及早期诊断提供依据。

　　

摘要

本研究通过分析与妊娠维持相关的差异表达蛋白（DAB），探讨了妊娠期间山羊血清的蛋白质组特征。共有102只健康的山羊接受了发情同步处理和人工授精（AI），并在AI后的第19天、第28天、第35天和第50天采集了血清样本。样本被分为五组：A1（第19天）、A2（第28天）、A3（第35天）、A4（第50天）和B（未妊娠），每组有五个生物学重复样本。利用数据独立获取（DIA）技术，共鉴定出19,740种蛋白质，并根据倍数变化标准（FC≥1.5或FC≤0.66且P<0.05）识别出2201种DAB。生物信息学分析表明，这些蛋白质在免疫反应、代谢、细胞增殖和生殖途径中富集。值得注意的是，VKORC1L1、PSTPIP2和CD40LG等蛋白质在妊娠早期持续上调，表明它们在胚胎发育和免疫调节中的作用。这些发现为了解山羊妊娠维持机制提供了宝贵的见解。

引言

山羊是最早被驯化的家畜之一，对人类具有重要意义，具有良好的繁殖性能，每年可产1到2胎，每胎产1到3只幼崽（Fatet等人，2011年）。然而，未能及时准确地诊断妊娠仍然是导致母山羊反复流产的关键因素（Pollock等人，2021年）。母山羊的管理水平和流产率是影响山羊生产效率的重要因素。妊娠包括关键事件（受精、分裂、着床、胚胎/胎盘发育）以及分子、细胞和信号通路的多层调控（Quan等人，2019年）。因此，血液蛋白质组学分析对于解码妊娠调控网络和识别早期妊娠检测的生物标志物至关重要，这对于提高山羊的繁殖效率至关重要。

DIA（数据独立获取）技术结合了传统蛋白质组学和基于质谱的绝对定量技术的优点和特点。与其他定量蛋白质组学技术相比，DIA具有全景扫描和数据可追溯性等优势（Wang等人，2019a；Wang等人，2019b）。一项先前使用DIA技术的研究分析了藏猪在妊娠0天、5天、12天、16天和19天的血清蛋白（Xin等人，2022年）。结果表明，差异表达蛋白（DAB）主要参与催化活性、代谢过程和蛋白酶体途径。这些发现表明，基于DIA的蛋白质组学是一种揭示多种血清蛋白在猪妊娠早期调节生理功能中作用的有效方法（Xin等人，2022年）。类似地，基于DIA的蛋白质组学分析发现，白质病变（WML）患者的血清中存在凝血酶激活纤维蛋白溶解抑制剂（TAFI），这种蛋白质可能促进外周单核细胞向WML区域的迁移（Wang等人，2024年）。通过基于DIA的蛋白质组学分析，比较了妊娠期肝内胆汁淤积症（ICP）患者和健康妊娠对照组的血清蛋白。鉴定出的蛋白质与特定的细胞过程相关，包括凋亡、脂质代谢、免疫反应、细胞增殖和代谢失调。这些发现表明，这些过程可能是ICP发病的关键致病因素（Nie等人，2023年）。

因此，监测山羊妊娠期间蛋白质浓度的变化可以有效地预测其生理状态并预防疾病的发生。然而，目前关于山羊妊娠期间血清蛋白表达变化的研究仍然有限。本研究采用DIA技术来检测不同妊娠阶段的血清蛋白差异表达，旨在分析参与DAB的信号通路和生物过程。这项研究将为进一步阐明山羊妊娠维持的分子机制以及开发新的诊断方法和技术策略提供基础数据。

动物和实验设计

本研究在中国山东省的一个农场选择了102只近期未分娩的健康山羊，进行发情同步处理和人工授精（AI），并根据妊娠期将它们随机分为四组。所有程序均获得了青岛农业大学动物护理和使用委员会的批准，并在整个实验过程中遵循了人道动物护理原则。通过颈静脉穿刺从交配后的山羊身上采集血液样本，每只山羊抽取5毫升血液。

蛋白质结果数据统计

每个样本均独立处理，蛋白质消化后，使用数据独立获取（DIA）技术进行分析。所得的原始DIA质谱文件被导入DIA-NN软件进行处理，选择标准为Q值≤0.01。共鉴定出19,740种蛋白质。图1显示了鉴定出的独特肽的数量分布。结果表明，在整个妊娠期间检测到了19,740种蛋白质。

胚胎发育期间的母体代谢变化

本研究应用DIA-MS技术分析了妊娠第19天、第28天、第35天和第50天的山羊血清样本，鉴定出5408种蛋白质和2201种DAB。GO注释显示，这些DAB在免疫调节、代谢、发育和细胞组织中富集。分子功能分析突出了催化、转运、翻译和抗氧化活性，而细胞成分则集中在解剖结构和蛋白质复合物上。

先前的研究表明，在妊娠期间……

结论

类固醇激素的动态平衡、抗氧化过程和免疫调节在妊娠的建立和维持中起着关键作用。PPAR、IL-17、Toll样受体、ErbB和cAMP等信号通路在免疫耐受、滋养层侵袭、合胞体形成、脂质和葡萄糖代谢以及炎症反应等生物过程中高度表达。对候选标记蛋白VKORC1L1、PSTPIP2进行的Western blot（WB）分析……

作者贡献声明

徐东亮：撰写——初稿、可视化、软件、方法学、研究、正式分析、数据管理。王迪：撰写——初稿、方法学、数据管理。周立生：方法学、正式分析。黄正刚：方法学、数据管理。孙明志：方法学。曹新新：方法学。周建宇：方法学。高晓晓：方法学。何建宁：方法学。赵金山：撰写——审稿与编辑、监督、资金获取。李 Hegang：

伦理批准和参与同意

所有动物的处理均严格遵循中华人民共和国的动物伦理程序和指南，本研究获得了青岛农业大学动物科学技术学院动物管理和伦理委员会的批准（许可编号DKY20230310）。

资助

本研究得到了生物育种-国家科学技术重大项目（2022ZD04014）、青岛市民生科学技术项目（23-2-8-xdny-9-nsh）、山东省自然科学基金（ZR2022MC094、ZR2020MC164）、中国自然科学基金（M2342004）、山东省羊业和 Goat 产业技术体系（SDAIT-10-02）以及山东省研究生教育改革项目（SDYJSJGC2023061）的支持。

未引用参考文献

Bigler等人，2023年；Lacombe和Ferron，2018年；Pino等人，2020年；Wi?niewski等人，2009年

利益冲突声明

作者声明在本研究中没有利益冲突。

致谢

作者衷心感谢Jimo市四季春奶山羊场和丁Pigang先生的帮助，以及上海Bioprofile Technology有限公司的支持。