纳米级3D DNA追踪技术揭示Cohesin依赖性基因组环状结构的原位构象

本研究通过开发"LoopTrace"工作流程，解决了传统FISH方法破坏DNA纳米级结构的难题，实现了非变性细胞中基因组3D折叠的原位高分辨率成像。研究人员利用改进的oligopaint FISH探针和自动化3D成像技术，首次在单细胞水平揭示了Cohesin依赖的DNA环状结构动态特征，发现基因组在100-kb尺度表现为柔性随机线圈，而在CTCF位点形成可变构象的Cohesin依赖性环。该研究为理解染色质高级结构调控机制提供了直接的结构证据，相关成果发表在《Nature Communications》上。

　　

基因组的三维组织结构对基因表达和染色体分离等关键生物学过程至关重要，但科学家们一直难以在原位直接观察其纳米级结构特征。传统染色体构象捕获技术(如Hi-C)虽然揭示了兆碱基(Mb)尺度的区室结构和拓扑关联域(TADs)，但这些方法依赖于群体细胞的平均数据，且无法提供单细胞水平的三维结构信息。更棘手的是，常用的荧光原位杂交(FISH)技术往往需要DNA变性处理，这可能会破坏染色质的精细结构。这些技术限制使得科学家们难以验证染色质相分离和环状挤出(loop extrusion)等理论模型在活细胞中的真实性。

欧洲分子生物学实验室(EMBL)的研究人员开发了一种名为"LoopTrace"的创新工作流程，成功实现了非变性细胞中基因组纳米级结构的高分辨率成像。这项研究通过结合温和的非变性oligopaint FISH标记和自动化3D成像技术，首次在单细胞水平揭示了Cohesin依赖的DNA环状结构动态特征，相关成果发表在《Nature Communications》上。

研究人员主要采用了四项关键技术：1)非变性RASER-FISH技术，通过酶促链切除实现单链标记，避免DNA变性；2)高密度oligopaint探针设计，实现10kb基因组分辨率；3)自动化微流控系统支持的多轮序贯成像，空间分辨率达30nm；4)基于单细胞3D轨迹的谱序列分析和贝叶斯高斯混合模型聚类。研究对象包括人视网膜色素上皮细胞(RPE-1)和HeLa细胞系，并通过auxin诱导降解系统(AID)实现Cohesin(RAD21)和CTCF的急性敲除。

【LoopTrace实现纳米级3D DNA追踪并改善结构保存】
研究人员比较了传统变性FISH和非变性FISH对基因组结构的影响。结果显示，变性处理导致DNA结构变异增加30%，距离分布标准差增大3倍以上。而非变性方法不仅保持了复制域的空间组织，还显著提高了追踪效率(完整轨迹比例从20%提升至76%)。这种改进使得研究人员能够以<30nm的3D精度解析基因组结构。

【LoopTrace在3D中直接可视化CTCF位点间单环的结构和异质性】
针对染色体17上MEOX1基因附近的100kb环状域，研究发现RPE-1细胞中存在开放、部分压缩和完全环化三种主要构象。通过谱序列分析，研究人员发现HeLa细胞的环状构象更为稳定，而Cohesin敲除后环状结构完全消失。值得注意的是，即使在野生型细胞中，仅约30%的细胞在CTCF位点间形成<100nm的紧密环状结构，表明环状构象具有显著的细胞间异质性。

【Cohesin在300kb尺度上依赖的基因组压缩】
在四个300kb区域的追踪中，研究人员发现Cohesin敲除导致染色质呈现理想随机线圈行为(ν=0.47±0.03)。野生型细胞中，每个300kb区域平均包含4个<100nm的长程接触，这些接触主要由两个100kb的Cohesin依赖性环堆叠形成。有趣的是，CTCF敲除并不影响整体压缩程度，但改变了环的空间分布，表明CTCF主要作为边界因子发挥作用。

【Mb尺度区域的3D折叠揭示稀疏和开放的环】
在1.3-1.8Mb的TAD尺度区域，研究发现平均每个区域仅形成2个长程物理接触。通过无监督聚类分析，研究人员发现这些接触主要发生在TAD边界与内部CTCF位点之间，形成多种可变构象。Cohesin敲除使接触数降至1以下，而CTCF敲除则重新分布了接触位置。这些结果表明，TAD结构由动态的、稀疏的环状接触组成，而非稳定的紧密结构。

【数据约束的聚合物模型预测环和TAD由少数Cohesin复合物形成】
研究人员建立了一个受实验数据约束的Rouse聚合物/环挤出模型。该模型成功预测了WAPL敲除导致的环延长现象(从393±14kb增至455±27kb)。模型参数表明，仅约30%的Cohesin复合物参与形成>10kb的环，且每个Mb区域平均有9个动态结合的Cohesin和45个CTCF分子。这些预测与实验观察高度吻合，误差<10%。

这项研究的重要意义在于首次提供了非变性条件下基因组纳米级结构的直接证据，证实了Cohesin依赖性环挤出模型的多个关键预测。研究发现基因组在单细胞水平呈现高度动态和异质的结构特征，群体水平的TAD结构实际上是稀疏环状接触的统计平均。LoopTrace技术的建立为未来研究染色质结构与功能的关系提供了强大工具，特别是在DNA复制、修复和细胞分裂等过程的研究中具有广阔应用前景。该工作还通过实验数据约束的数学模型，量化了Cohesin和CTCF在基因组折叠中的动态参数，为理解这些因子的工作机制提供了新见解。

研究结果支持了"染色质相分离和环挤出共同调控基因组空间组织"的理论框架，同时也揭示了单细胞水平的结构复杂性。这种纳米级分辨率的单细胞分析方法将有助于揭示基因组结构变异与疾病的关系，为表观遗传学研究和疾病机制探索开辟了新途径。