心肌细胞OTUD1通过去泛素化AMPKα2诱导线粒体功能障碍驱动糖尿病心肌病的机制研究

本研究揭示了去泛素化酶OTUD1在糖尿病心肌病(DCM)中的关键作用。研究人员发现心肌细胞特异性OTUD1缺失通过直接去泛素化AMPKα2的K60/K379位点，恢复AMPKT172磷酸化水平，改善线粒体功能，从而缓解T1DM和T2DM模型小鼠的心肌肥大和功能障碍。该研究首次阐明OTUD1-AMPK轴在DCM中的调控机制，为糖尿病心脏并发症提供了新的治疗靶点。

　　

糖尿病已成为全球性健康危机，其心血管并发症是糖尿病患者死亡的主要原因。糖尿病心肌病(Diabetic Cardiomyopathy, DCM)作为糖尿病的独立并发症，表现为心肌僵硬、肥大、纤维化以及随之而来的心脏收缩和舒张功能障碍。尽管临床治疗取得进展，但针对DCM的特异性治疗手段仍然有限。长期以来，高血糖引起的能量代谢紊乱被认为是DCM发展的核心机制，其中线粒体功能障碍尤为关键——心肌细胞中约95%的ATP依赖线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)产生。临床研究显示，糖尿病心脏中线粒体ATP生成不足、氧合能力下降，导致活性氧(ROS)积累和氧化应激加剧。AMP活化蛋白激酶(AMPK)作为心肌细胞能量稳态的关键调节因子，其活性降低与糖尿病心脏线粒体不稳定性和心功能恶化密切相关。

浙江大学的研究团队在《Nature Communications》发表重要研究成果，通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术发现卵巢肿瘤结构域蛋白1(OTUD1)在糖尿病心脏中显著上调。研究人员构建了心肌细胞特异性OTUD1敲除小鼠，证明OTUD1缺失可预防1型和2型糖尿病雄性小鼠的心肌肥大和功能障碍。机制上，OTUD1直接结合AMPKα2亚基，通过其活性位点C320去除AMPKα2在K60/K379位点的K63连接泛素化，阻碍AMPKα2与上游激酶CAMKK2的相互作用，从而抑制AMPKT¹⁷²磷酸化。最终，心肌细胞中沉默AMPKα2可消除OTUD1缺失对糖尿病小鼠的心脏保护作用。

研究采用多项关键技术：单细胞RNA测序分析糖尿病心脏细胞亚群分布；构建心肌细胞特异性OTUD1敲除小鼠模型；通过免疫共沉淀(Co-IP)和生物层干涉仪(BLI)验证OTUD1-AMPKα2相互作用；利用腺相关病毒(AAV9)介导的基因沉默技术进行功能验证；采用线粒体呼吸测定和ATP检测评估能量代谢变化。

主要研究结果：

心肌细胞来源的OTUD1在糖尿病心脏中显著上调
单细胞RNA测序显示，OTUD1在糖尿病心脏中表达增幅最大(Log2FC=1.14)，且主要分布于心肌细胞。免疫荧光证实OTUD1在α-肌动蛋白阳性心肌细胞中特异性增加，高糖(HG)和棕榈酸(PA)处理可时间依赖性上调原代心肌细胞中OTUD1表达和去泛素酶活性。

心肌细胞特异性OTUD1敲除改善T2DM小鼠心脏肥大和功能障碍
在STZ联合高脂饮食诱导的T2DM模型中，OTUD1敲除不改变血糖和体重，但显著降低血清LDH和ANP水平。超声心动图显示OTUD1缺失改善射血分数(EF%)和短轴缩短率(FS%)，减轻心肌细胞横截面积增大和纤维化标志物表达。

OTUD1缺失通过恢复AMPK磷酸化增强线粒体OXPHOS
RNA测序分析发现OTUD1敲除糖尿病心脏中AMPK信号通路和线粒体OXPHOS显著富集。Western blot证实OTUD1缺失恢复糖尿病心脏中AMPKT¹⁷²和ACC磷酸化水平，改善线粒体形态，增加ATP含量和呼吸链复合体II、III、IV表达。

OTUD1促进心肌细胞线粒体损伤和肥大
在原代心肌细胞中，OTUD1沉默逆转HG+PA诱导的AMPK磷酸化抑制，减少线粒体ROS和细胞肥大；而OTUD1过表达加剧这些异常。在AMPKα2敲除的H9C2细胞中，OTUD1沉默不再影响肥大基因表达，证实其作用依赖AMPK。

OTUD1直接结合并去泛素化AMPKα2
质谱分析鉴定出608个OTUD1结合蛋白，其中AMPKα2与DCM最相关。免疫共沉淀证实OTUD1与AMPKα2在糖尿病心脏和HG+PA处理心肌细胞中相互作用增强。结构域分析显示OTUD1通过其OTU结构域结合AMPKα2的激酶结构域(KD)。

OTUD1通过C320活性位点调控AMPKα2去泛素化
OTUD1显著降低AMPKα2泛素化水平，特别是K63连接泛素化。突变分析确定K60和K379是OTUD1介导的去泛素化关键位点。酶活性突变体OTUD1-C320A丧失去泛素化能力，无法抑制AMPK-CAMKK2相互作用和T¹⁷²磷酸化。

心脏AMPKα2敲除消除OTUD1缺失的保护作用
AAV9介导的心肌细胞AMPKα2沉默抵消了OTUD1敲除对db/db小鼠心功能、线粒体形态和呼吸链复合体的改善作用，证实OTUD1通过AMPKα2发挥心脏保护效应。

这项研究首次阐明OTUD1作为AMPK的直接调控去泛素化酶，在糖尿病心肌病发生发展中起关键作用。发现的OTUD1-AMPK轴不仅为理解DCM的分子机制提供新视角，更提示靶向OTUD1可能是治疗糖尿病心脏并发症的可行策略。鉴于AMPK激活剂开发的困难，设计特异性OTUD1抑制剂可能成为更可行的治疗途径。该研究为糖尿病心血管并发症的精准治疗提供了重要的理论基础和潜在干预靶点。