一种评估无细胞百日咳联合疫苗终产品中百日咳毒素活性的96孔板体外检测新方法

为解决传统小鼠组胺致敏试验(HIST)在评估百日咳疫苗安全性时存在的动物伦理和标准化难题，研究人员开发了基于胎球蛋白-ADP核糖基化反应(fetuin-ADPR)的96孔板体外检测法。该方法通过磁珠捕获保留碳水化合物结合活性的PT抗原，并检测其ADP-核糖基转移酶活性，成功应用于DPT、DPT-IPV等联合疫苗终产品的毒性评估，检测限达20 ng/mL，为替代动物实验提供了可靠方案。

　　

百日咳这个让婴幼儿闻风丧胆的呼吸道传染病，其罪魁祸首百日咳杆菌产生的百日咳毒素(PT)既是致病元凶，也是疫苗关键成分。传统疫苗安全性检测依赖小鼠组胺致敏试验(HIST)，不仅每年消耗6.5万只小鼠，还存在结果标准化困难等问题。随着"3R原则"（减少、替代、优化动物实验）在科研伦理中的重要性日益凸显，开发可靠的体外替代方法成为当务之急。

研究人员注意到，PT要发挥毒性必须同时具备两种"武器"：S1亚基的ADP-核糖基转移酶活性（能使G蛋白α亚基ADP核糖基化）和B寡聚体的碳水化合物结合活性。此前单独检测任一种活性的方法（如E-HPLC或糖结合试验）与动物实验结果相关性不佳。为此，研究团队创新性地将两种检测策略整合到96孔板中，建立了胎球蛋白-ADPR检测系统。

这项研究的关键技术路线包含三个核心环节：首先利用胎球蛋白包被磁珠捕获疫苗中的PT抗原，确保检测对象具有完整糖结合能力；随后在固定有Gα_i3C20肽的微孔板中，通过生物素标记的NAD⁺检测ADP-核糖基转移酶活性；最后采用链霉亲和素-HRP显色系统进行定量分析。所有实验均使用DPT、DPT-IPV等市售联合疫苗的终产品作为检测样本。

【Fetuin-ADPR assay for the PT reference NIBSC 90/518】
研究显示，该方法对PT标准品NIBSC 90/518在10-320 ng/mL范围内呈现优异线性（R²≥0.98），证实系统具有可靠的定量能力。特别值得注意的是，当PT浓度达到320 ng/mL时，吸光度仍保持线性增长，表明该方法具有较宽的检测范围。

【Activatable PT content in acellular pertussis combination vaccines】
对实际疫苗样本的检测发现，4℃保存的疫苗中可激活PT含量均低于20 ng/mL（检测限），而37℃加速稳定性试验28天的样本则检测到<20-159.7 ng/mL的活性PT。这一结果不仅验证了方法对"毒性回复"现象的检测能力，也与疫苗热稳定性要求高度吻合。

【Discussion】
胎球蛋白-ADPR检测法的日间变异系数为27.5%，加标回收率44-50%，虽然精度有待提升，但其优势在于：一是能同时评估PT的双重毒性机制；二是采用标准96孔板格式，便于推广；三是直接适用于含佐剂的终产品检测。这为疫苗批签发提供了一种符合"3R"原则的替代方案。

该研究由Kazunari Kamachi和Tsuyoshi Kenri合作完成，论文发表在《Vaccine》期刊。研究者特别指出，当前欧洲药典虽已对疫苗中间产品采用CHO细胞试验替代HIST，但对终产品仍缺乏统一标准。这项研究首次建立了适用于终产品的双重活性检测体系，为全球疫苗监管体系革新提供了重要技术支撑。未来通过优化磁珠捕获效率和信号放大系统，有望进一步提高方法的灵敏度和精确度，最终实现完全替代动物实验的目标。