SMAdd-seq技术：基于小分子DNA嵌入和纳米孔测序的染色质可及性探测新方法

研究人员开发了一种名为SMAdd-seq的新型纳米孔测序技术，通过小分子angelicin标记可及DNA区域，结合神经网络模型NEMO分析染色质结构。该技术可在酵母细胞核和完整细胞中实现单分子水平的染色质动态和异质性检测，为表观遗传研究提供了更精准的工具。

　　

在真核细胞中，DNA如何被包装成染色质一直是生命科学的核心问题。核小体像一串珍珠般排列在DNA上，它们的分布不仅影响基因表达，还与发育、疾病和药物反应密切相关。传统方法如MNase-seq和ATAC-seq虽然能绘制核小体图谱，但存在明显局限：它们需要提取细胞核，可能破坏天然染色质状态；依赖短读长测序，只能提供群体平均信息；且受PCR扩增偏好的影响。这些限制使得科学家们难以捕捉单个细胞中染色质结构的动态变化和分子异质性。

美国加州大学圣克鲁兹分校（University of California, Santa Cruz）生物分子工程系和分子细胞与发育生物学系的Gali Bai等研究人员在《Nucleic Acids Research》发表创新成果，开发了SMAdd-seq技术。这项研究利用小分子angelicin的特性——它能优先与连接DNA中的胸腺嘧啶形成光加合物，并通过纳米孔测序检测这些修饰。研究团队还开发了神经网络模型NEMO，用于从长读长数据中准确识别修饰位点。结果显示，该方法能在单分子水平解析染色质结构，发现酵母基因组中不同位点的构象异质性，且对完整细胞和分离细胞核的效果相当。

关键技术包括：（1）使用500μM angelicin处理酵母细胞核或原生质体，通过多轮UV照射形成共价加合物；（2）牛津纳米孔MinION测序平台进行长读长测序；（3）开发ResNet1D架构的神经网络模型NEMO，通过400个信号窗口分析修饰概率；（4）基于5440个+1核小体dyad位点的全基因组聚集分析；（5）单分子聚类揭示染色质构象异质性。

SMAdd-seq技术原理验证方面，研究发现angelicin修饰主要发生在5'-TA二核苷酸上，特别是5'-TAT三核苷酸。通过比较修饰与未修饰DNA的纳米孔电流信号，确认了169个具有特征性信号偏移的k-mer。神经网络模型NEMO在测试数据集上达到AUC 0.9的优异性能，能准确区分修饰与非修饰信号。

染色质结构分析结果显示，在转录起始位点（TSS）附近，SMAdd-seq成功捕捉到预期的核小体周期性模式：+1核小体下游呈现规律的核小体阵列，而上游区域保持开放。这一模式与PacBio甲基化数据高度一致，验证了方法的可靠性。值得注意的是，在-150bp位置观察到的信号下降与酵母TSS区域5'-TA motif的分布特征相关。

单分子异质性研究发现，通过k-means聚类可识别不同染色质状态。例如在zz-YIL161W基因位点，一个簇（C1）显示完整的+1至+3核小体阵列，而另一个簇（C2）仅保留+1核小体，反映转录活性差异。CLN2启动子区域的分析则揭示了核小体缺失区（NDR）与基因激活状态的关联。特别有趣的是在NUP170/PET112双向启动子区域，研究人员观察到三种构象：仅PET112启动子开放（C1）、双启动子开放（C2）和全局开放（C3），展现了染色质调控的复杂性。

这项研究的意义在于建立了首个基于小分子嵌入的纳米孔染色质分析技术。相比传统方法，SMAdd-seq具有三大优势：（1）无需提取细胞核，可直接在完整细胞中标记，最大限度保持染色质天然状态；（2）长读长测序能揭示单分子水平的构象异质性和远程协调性；（3）成本仅为酶学方法的1/100。尽管存在修饰效率不均和纳米孔阻塞等技术挑战，该方法为表观遗传学研究开辟了新途径，特别适用于低起始量样本和难以分离细胞核的组织。未来通过优化angelicin衍生物和采用双链测序技术，有望进一步提升该技术的灵敏度和通量。