真菌RNA帽N7甲基转移酶对抗真菌抗生素sinefungin敏感性和获得性耐药的结构基础

本研究揭示了真菌mRNA帽(guanine-N7)甲基转移酶Abd1对抗生素sinefungin(SFG)高度敏感的结构机制。研究人员通过X射线晶体学解析了Kluyveromyces lactis和Saccharomyces cerevisiae Abd1与SFG及底物GTP的复合物结构，发现SFG通过其C-NH2胺基与GTP形成两个额外的氢键，从而解释了SFG相比S-adenosylhomocysteine(SAH)高达485倍的抑制效力。通过遗传筛选获得的SFG耐药突变体证实Tyr416是决定SFG效力的关键残基，为开发新型抗真菌药物提供了重要靶点。

　　

在微生物与人类的长期博弈中，真菌感染始终是威胁人类健康的重大挑战。世界卫生组织(WHO)已将多种真菌病原体列为重点防控对象，而现有抗真菌药物面临耐药性增加和选择性不足等问题。在这场对抗中，科学家们将目光投向了真菌生存必需但人类同源蛋白存在差异的靶点——mRNA帽(guanine-N7)甲基转移酶(RNA(guanine-N7) methyltransferase)。这种酶负责催化真核生物mRNA特征性的m⁷GpppRNA帽结构形成，是真菌生长的关键环节。

来自Albert Einstein College of Medicine、Weill Cornell Medical College和Memorial Sloan Kettering Cancer Center的研究团队在《Nucleic Acids Research》发表的研究，揭示了天然抗生素sinefungin(SFG)选择性抑制真菌帽甲基转移酶的结构基础。SFG作为S-adenosylmethionine(SAM)类似物，其抗真菌活性被认为是通过抑制真菌帽甲基转移酶Abd1实现的，但具体分子机制一直未被阐明。这项研究不仅解开了这一谜团，还发现了真菌产生耐药性的关键位点，为开发新型特异性抗真菌药物提供了重要线索。

研究人员采用多种关键技术开展研究：通过大肠杆菌表达系统制备重组Kluyveromyces lactis和Saccharomyces cerevisiae Abd1蛋白；建立基于液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)的高灵敏度甲基化活性检测方法；运用X射线晶体学解析了Abd1与产物S-adenosylhomocysteine(SAH)、抑制剂SFG以及底物GTP的多种复合物结构；通过遗传筛选从酿酒酵母中获得SFG耐药突变株并鉴定关键突变位点。

Structural basis for sensitivity and acquired resistance of fungal cap guanine-N7 methyltransferases to the antifungal antibiotic sinefungin

研究首先比较了全长和截短体KlAbd1的酶活性，发现去除N端137个氨基酸的KlAbd1△137仍保持完整活性，这为后续晶体学研究提供了理想材料。通过LC-MS/MS检测系统定量分析甲基化产物m⁷GpppA的形成，测得野生型KlAbd1对GpppA的转换率为5.4±0.5 min^-1。

Methyltransferases activity of K. lactis Abd1

晶体结构分析显示，KlAbd1△137与SAH复合物的分辨率达到1.3 ?。结构显示SAH结合在甲基供体位点，与保守的Ile192、Phe222、Tyr251等残基形成广泛相互作用。特别值得注意的是，SAH的羧基氧与Lys151-Nζ和水分子形成网络状氢键，这些精细的相互作用为理解SFG的高效抑制提供了结构基础。

Structure and active site of K. lactis Abd1

抑制实验获得了关键发现：SFG抑制KlAbd1的IC₅₀为52.1±13.1 nM，而SAH的IC₅₀为12.3±4.1 μM，表明SFG的抑制效力是SAH的240倍。这一巨大差异促使研究人员解析了KlAbd1与SFG的复合物结构。

Potent inhibition of KlAbd1 by SFG

1.42 ?分辨率的KlAbd1△137·SFG·GTP三元复合物结构揭示了决定性发现：SFG的C-NH₂胺基不仅与Phe247主链羰基形成氢键（类似SAH中甲基的范德华作用），还额外与GTP的O6(2.9 ?)和N7(2.8 ?)原子形成两个特异性氢键。这种"底物辅助抑制"机制完美解释了SFG相比SAH的显著优势。

Ternary complex of KlAbd1△137, SFG, and GTP

通过遗传筛选获得的SFG耐药突变体均含有Tyr416突变（如Y416C、Y416N、Y416F）。酶学分析显示这些突变使SFG的IC₅₀增加约20倍（从65 nM升至1.3-1.5 μM），但对SAH的敏感性几乎不变。2.8 ?分辨率的ScAbd1△140-K163R-K311R-F387Y-Y416F·SFG·GTP结构显示，虽然SFG与GTP的直接氢键得以保留，但Tyr416突变为苯丙氨酸后，失去了与GTP-N3和核糖O2'的关键氢键，导致GTP结合减弱，这解释了耐药性的产生。

Isolation of SFG-resistant S. cerevisiae with mutations in the ABD1 gene

这项研究系统阐明了真菌帽甲基转移酶Abd1对SFG高度敏感的结构基础，发现SFG通过独特的三重氢键网络（与酶主链和底物GTP）实现高效抑制。遗传筛选证实Tyr416是决定SFG效力的关键残基，其突变通过削弱帽结合而引发耐药。这些发现具有多重重要意义：首先，揭示了Abd1作为抗真菌药物靶点的可行性；其次，发现Tyr416在病原真菌中高度保守，提示针对该位点的抑制剂可能具有广谱抗真菌活性；最后，研究提出的"底物辅助抑制"机制为设计新型bisubstrate抑制剂提供了思路。特别值得注意的是，该研究比较了真菌与人类帽甲基转移酶的结构差异，为开发高选择性抗真菌药物奠定了理论基础。这些发现不仅对抗真菌药物研发具有指导价值，也为理解蛋白质-小分子相互作用的精细调控提供了范例。