非靶向CUT&Tag技术在G4靶向实验中的干扰：染色质可及性对G4序列鉴定的影响及优化策略

本研究针对G4靶向CUT&Tag实验中非特异性信号富集问题，通过系统分析非靶向CUT&Tag数据与ATAC-seq、G4靶向技术的相关性，发现低复杂度非靶向文库会干扰G4序列鉴定。研究人员采用SEACR算法和复杂度归一化方法，证实考虑非靶向信号可提高G4定位精度但会降低检出率，为优化G4定位技术提供了重要依据。

　　

在基因组调控领域，G-四链体(G-quadruplex, G4)这种特殊的DNA二级结构正引发越来越多的关注。这些由鸟嘌呤富集序列通过Hoogsteen碱基配对形成的四链结构，如同基因组中的"分子开关"，广泛参与基因表达调控、DNA复制和基因组稳定性维持等重要生物学过程。特别值得注意的是，G4在癌细胞中的丰度显著高于正常组织，使其成为极具潜力的抗癌治疗靶点——目前已有两种G4配体进入临床试验阶段。然而，要充分发挥G4的生物学研究和临床应用价值，首要任务是实现这些结构的精准定位。

传统G4定位技术面临诸多挑战：染色质免疫沉淀(ChIP-seq)需要大量起始材料且信噪比低；基于微球菌核酸酶(MNase)的G4Access方法虽能反映染色质可及性，但分辨率有限。近年来兴起的CUT&Tag技术因其高灵敏度、低样本需求等优势，被成功改造用于G4定位，包括使用BG4抗体、SG4纳米抗体以及G4结合小分子(PDS/PhenDC3)等不同靶向策略。然而，这些方法都存在一个共性现象——G4靶向信号与非靶向CUT&Tag信号存在显著共定位，这不禁让人质疑：我们检测到的究竟是真实的G4信号，还是仅仅反映了染色质的开放状态？

来自阿肯色大学医学中心(University of Arkansas for Medical Sciences)的Matthew D. Thompson和Alicia K. Byrd研究团队在《Nucleic Acids Research》发表的重要研究，系统解答了这一关键技术难题。研究人员整合分析多种细胞系的公开测序数据，采用生物信息学方法包括SEACR峰值调用、DiffBind差异富集分析和HOMER基序发现等关键技术，通过复杂度归一化处理消除文库偏差，比较了非靶向CUT&Tag与ATAC-seq、多种G4定位技术的相关性。

研究结果部分，"低复杂度非靶向CUT&Tag样本具有共享的基因组富集模式"揭示：来自不同实验室、不同细胞系的非靶向CUT&Tag数据在启动子等调控区域呈现保守的富集模式，且与G/C富集序列(如Sp1转录因子结合位点)显著相关。"非靶向CUT&Tag文库与G4共定位"部分证实：非靶向信号与ATAC-seq信号高度相关(r>0.7)，且与所有G4定位方法(BG4/SG4 CUT&Tag、Chem-map、G4Access)的检测结果存在显著重叠。"匹配非靶向对照文库的使用限制G4检出"部分发现：当采用非靶向对照进行差异分析时，K562细胞中BG4 CUT&Tag的显著差异峰从8679个锐减至1008个，HEK293T细胞中SG4 CUT&Tag仅鉴定出15个差异峰。

在结论与讨论部分，研究强调非靶向CUT&Tag信号实质上是染色质可及性与潜在G4结构的"叠加信号"。这一发现对G4研究领域具有双重意义：一方面警示研究者谨慎解读现有G4定位数据，避免将开放染色质信号误判为G4结构；另一方面为技术优化指明方向——通过调整盐浓度等实验条件抑制非特异切割，或结合DHX36敲除等生物学验证来提高特异性。该研究建立的复杂度归一化分析框架，为评估不同G4定位技术的性能提供了重要参考标准，将推动这一领域向更精确、更可靠的方向发展。