二甲基磺基丙酯裂解酶基因dddY的克隆表达及其关键活性氨基酸位点的鉴定与功能解析

本研究针对海洋生态系统中关键溶质二甲基磺基丙酯(DMSP)的微生物降解机制，通过分离Acinetobacter sp. ZS25菌株，结合基因组比较、基因敲除和异源表达技术，鉴定了DMSP裂解酶DddY的功能特性。研究测得其对DMSP的Km为2.6 mM，kcat达12.7×103 s-1，并通过定点突变揭示了12个关键氨基酸残基的作用。生物信息学分析发现19种不同的acu-dddY基因簇排列类型，为理解DMSP生物降解机制及细菌种群中acu-dddY簇的多样性提供了新见解。

　　

海洋环境中，二甲基磺基丙酯(DMSP)是一种年产量高达10⁹吨的重要有机硫化合物，在营养循环、气候调节和生物行为中扮演关键角色。微生物通过多种途径降解DMSP，其中裂解途径产生的挥发性二甲基硫醚(DMS)直接影响全球硫循环和云层形成。然而，关于DMSP裂解酶DddY的分子机制及其在自然环境中的分布特征仍存在诸多未知。

为深入解析这一问题，来自国内研究机构的研究人员从周口公园沉积物中分离获得一株能完全矿化DMSP的Acinetobacter sp. ZS25菌株。通过基因组测序和功能验证，研究人员发现该菌株含有完整的dddY-acu基因簇，其中dddY基因编码的DMSP裂解酶能将DMSP分解为DMS和丙烯酸酯。相关研究成果发表在《Current Research in Microbial Sciences》上。

研究采用的主要技术方法包括：从环境样本中富集分离DMSP降解菌株；通过基因敲除和回补实验验证基因功能；异源表达和纯化His标签蛋白进行酶学性质分析；定点突变技术鉴定关键氨基酸位点；生物信息学方法分析基因簇多样性；实时定量PCR检测基因表达水平。

研究结果部分：
3.1. DMSP降解菌株的分离与鉴定
从沉积物样品中分离获得能利用DMSP作为唯一碳源的Acinetobacter sp. ZS25，经16S rRNA基因序列分析鉴定为Acinetobacter属，与Acinetobacter baylyi DSM 14961^T相似度达99.86%。

3.2. 菌株ZS25中DMSP的降解途径
基因组分析发现包含dddY、acuNK、dddA、dddC等基因的完整代谢通路，与已知DMSP降解菌Alcaligenes faecalis M3A的相应基因具有81%-85%的相似性。

3.3. DddY的功能验证
RT-qPCR显示DMSP可诱导dddY等基因表达上调12.2倍；基因敲除实验证实dddY缺失导致DMSP转化能力部分丧失，回补后功能恢复。

3.4. DddY的表达与特性
重组AsDddY的最适温度为50°C，最适pH为8.0，K_m值为2.6 mM，k_cat达12.7×10³ s^-1，催化效率显著高于其他已知DMSP裂解酶。

3.5. DddY的关键氨基酸残基突变
发现His263、His265、Glu269、Tyr271和His338五个位点对酶活性至关重要，这些残基位于cupin超家族的两个保守基序中。

3.6. dddY-acu基因簇分析
鉴定出19种不同的基因簇排列类型，系统发育分析表明DddY蛋白与其宿主存在共进化关系。

研究结论与讨论部分指出，这是第四个被详细表征的DddY同源蛋白，其高k_cat值和周质定位特征提示其在DMSP代谢中的关键作用。通过定点突变首次系统鉴定了AsDddY的12个关键氨基酸残基，特别是两个cupin基序中的保守位点对维持酶活性不可或缺。发现的19种acu-dddY基因簇排列类型反映了该代谢通路的进化多样性。这些发现不仅丰富了DMSP降解的分子机制认识，也为理解海洋硫循环的微生物驱动机制提供了新视角。值得注意的是，DddY对DMSP类似物的高效转化能力暗示其在环境适应性方面具有特殊优势，这为开发基于DMSP代谢的环境修复技术提供了理论依据。