针对入侵性月形螺（Laguncula pulchella）的沉积DNA检测方法的开发 这种螺类主要捕食马尼拉蛤（Ruditapes philippinarum）

《Estuarine, Coastal and Shelf Science》：Development of a sedimentary DNA detection assay for the invasive moon snail Laguncula pulchella preferentially preying on the Manila clam Ruditapes philippinarum

月螺入侵导致日本马氏珍珠贝产量骤降，传统检测方法存在漏检风险。本研究开发基于沉积DNA（sedDNA）的分子检测技术，通过分析14个基因型设计特异性引物探针，并在模拟环境中验证检测灵敏度达10^8拷贝/克。该技术可精准评估隐蔽分布的月螺，为入侵防控提供新手段。

　　月球螺（*Laguncula pulchella*）是一种原产于中国和朝鲜半岛的物种，近年来已入侵日本，并且其分布范围正在不断扩大。该物种以活体 Manila 蛤（*Ruditapes philippinarum*）为主要食物来源。值得注意的是，日本全国范围内的 Manila 蛤产量近年来显著下降，尽管其主要下降原因尚未明确，但月球螺的捕食行为被认为是影响北部地区产量的重要因素之一。为了有效控制月球螺的扩散和减少其对 Manila 蛤的捕食压力，必须采取高效的清除措施。然而，月球螺常常潜入沉积物中，这使得其在传统视觉调查中难以发现，可能导致以往调查低估了其存在和分布范围。因此，开发一种新的、高效且经济的调查方法显得尤为重要。

近年来，环境 DNA（eDNA）技术的发展为检测生物的分布提供了新的可能性。eDNA 是生物体留下的 DNA 片段，来源于水体和沉积物中的生物黏液、排泄物等。通过 eDNA 分析，可以判断目标生物的存在与否，从而为评估其分布范围提供可靠的数据。eDNA 技术在水体样本中已被广泛应用于检测多种生物，例如淡水中的 *Potamopyrgus antipodarum* 和 *Pomacea canaliculata*。然而，与水体相比，沉积物中的 eDNA（即 sedDNA）由于其能够吸附在黏土矿物上，具有更强的稳定性，因此浓度更高。这使得在沉积物中进行 eDNA 分析成为一种更有效的手段。此外，对于月球螺而言，由于其在海底爬行或潜入沉积物中，与 sedDNA 的兼容性较高，这为利用 sedDNA 技术检测该物种提供了理论基础。然而，目前尚未有针对月球螺的 sedDNA 分析研究。

本研究的目标是开发一种基于月球螺的 sedDNA 检测方法，以更准确地评估其分布情况。为了实现这一目标，我们首先评估了月球螺的遗传多样性及其与其他物种的系统发育关系。基于此，我们设计了针对所有 14 个单倍型的特异性引物和探针。此外，我们还在理想的水族箱环境中验证了月球螺 sedDNA 的检测能力。通过这些实验，我们成功地确认了该检测方法的可行性，并期望该方法能够有效识别月球螺的存在，即使在视觉上难以察觉的情况下。这一成果不仅有助于控制月球螺的扩散，还可能为减少其对 Manila 蛤的捕食压力提供科学依据。

Manila 蛤作为一种重要的经济贝类，原产于印度-太平洋地区，主要分布于东亚，同时也出现在北美和欧洲的太平洋沿岸。在北美，该物种于 1936 年首次被发现，但据信这些种群是随着从日本进口的牡蛎无意中引入的（Quayle, 1964; Cohen and Carlton, 1995）。随后，Manila 蛤从加拿大被引入法国和英国，用于商业养殖（Flassch and Leborgne, 1992）。法国和英国的种群又被进一步传播到意大利、西班牙、葡萄牙和挪威（Chiesa et al., 2016, 2017; Flassch and Leborgne, 1992; Hopkins, 2001; Velez et al., 2015）。随着这些种群在自然环境中的扩散，它们在法国的英吉利海峡沿岸和地中海沿岸、英国的南部海岸等地区形成了自然化种群（de Montaudouin et al., 2016; Humphreys et al., 2007, 2010, 2015）。在法国，Arcachon 湾的 Manila 蛤种群已成为一个重要的天然资源，贡献了该国总产量的 80%（Caill-Milly et al., 2021）。因此，Manila 蛤的分布范围因人为引入而迅速扩大，成为许多国家的重要渔业资源。然而，Manila 蛤的产量主要集中在东亚地区，包括日本、韩国和中国，这三个国家共同承担了全球大部分的产量。在日本，Manila 蛤已被用作食物来源超过 3000 年，其历史可以追溯到绳文时代，考古学家在各地的贝壳堆积层中发现了大量贝壳（Habu et al., 2011; Matsushima and Ohshima, 1974）。尽管在日本是一种广为人知的贝类，但近年来，其产量却显著下降。1983 年，Manila 蛤的捕捞量曾达到约 160,000 吨，但此后逐渐减少，到 2022 年已降至约 4,500 吨（MAFF, 2024）。相比之下，中国在 2022 年的产量约为 4,000,000 吨，并且近年来呈现出逐年增长的趋势（DOF, 2022）。在当前的条件下，日本很难继续维持 Manila 蛤作为渔业资源的地位。虽然目前尚未明确导致捕捞量下降的主要原因，但捕食行为被认为是其中一个重要因素（Toba, 2017; Toba et al., 2020a, 2020b）。全球公认的 Manila 蛤捕食者包括多种鸟类，如肉食性鸭子 *Aythya fuligula*、*A. ferina*、蛎鹬 *Haematopus ostralegus*、鸥类（Laridae）和乌鸦（Corvidae）（Humphreys et al., 2015; Kitagawa et al., 2021; Sekiya et al., 2000），以及一些鱼类，如黑海鲈 *Acanthopagrus schlegelii* 和 Naru 鹦嘴鱼 *Aetobatus narutobiei*（Jamieson et al., 2001; Tezuka et al., 2021）。此外，底栖捕食者如日本岸游蟹 *Charybdis japonica*、*Portunus trituberculatus*、Rapana 螺 *Rapana venosa* 和月球螺 *Glossaulax didyma* 等也被认为是 Manila 蛤的重要捕食者（Hu et al., 2016; Liu et al., 2023; Saito et al., 2007; Sun et al., 2017）。

在日本，入侵性的月球螺已被确认为 Manila 蛤的主要捕食者之一。月球螺属于月螺科，是一种以活体 Manila 蛤为食的物种。它主要分布在中国的潮间带和朝鲜半岛，而在日本西南部的分布则较为有限，且在 1996 年被列为濒危物种（Wada et al., 1996）。然而，自 20 世纪 80 年代末以来，随着来自中国和朝鲜半岛的 Manila 蛤开始被大量引入日本，月球螺也一同进入日本（Okoshi, 2004）。成年月球螺和其卵块在东日本地区被发现，而该地区原本并不适合该物种的生存。根据 Ohtsuki 等人（2016）的研究，通过对月球螺的细胞色素 c 氧化酶亚基 I（COI）基因进行遗传分析，发现东日本地区的种群具有明显的外来特征，支持了人为引入的假设。此外，月球螺也在日本西部的多个地区被发现（Okoshi, 2004; Yoshida et al., 2017）。然而，由于持续从大陆进口 Manila 蛤，这些种群被认为是入侵性的。此外，在日本东北部，月球螺的捕食行为已经引发了 Manila 蛤捕捞量的显著下降，并导致了一些采蛤区域的关闭（Okoshi, 2004, 2007, 2016）。随着月球螺在日本各地的扩散，其捕食行为可能影响多个区域的 Manila 蛤种群。为了防止其进一步扩散和减少对 Manila 蛤的捕食压力，有必要准确掌握月球螺的分布范围，并采取高效的清除措施。然而，由于月球螺常常潜入沉积物中，传统视觉调查难以发现其存在，这可能导致以往的调查低估了其分布情况。此外，月球螺的繁殖方式为直接发育，每枚卵块可产生约 4,000 个幼体（Okoshi, 2007）。因此，实际存在的活体月球螺数量可能比预期的更多。换句话说，以往的调查可能低估了该物种的存在和分布范围。因此，有必要开发一种新的、高精度且成本较低的调查方法。

随着 eDNA 技术的发展，现在可以利用水体和沉积物中的 DNA 片段来估计生物的分布情况。eDNA 分析通过检测目标生物的 DNA 来判断其是否存在，这种数据对于评估目标物种的分布范围具有重要价值（M?chler et al., 2014; Piaggio et al., 2014; Sigsgaard et al., 2014）。尽管目前针对软体动物的 eDNA 研究主要集中在淡水环境中，但已有多个关于检测 *Potamopyrgus antipodarum* 和 *Pomacea canaliculata* 等物种 eDNA 的报告（Clusa et al., 2016; Ponce et al., 2021; Zhou et al., 2024）。然而，与水体相比，沉积物中的 eDNA 更加稳定，因为其能够吸附在黏土矿物上，从而减少降解。这使得在沉积物中进行 eDNA 分析成为一种更有效的手段。此外，对于月球螺而言，由于其在海底爬行或潜入沉积物中，与沉积物中的 eDNA 具有较强的兼容性，这为利用 sedDNA 技术检测该物种提供了可能。然而，目前尚未有针对月球螺的 sedDNA 分析研究。

因此，本研究的目标是开发一种基于月球螺的 sedDNA 检测方法。具体来说，我们首先评估了月球螺的遗传多样性和其与其他物种的系统发育关系，基于此设计了特异性引物和探针。此外，我们还在理想条件下的水族箱环境中验证了月球螺 sedDNA 的检测能力。通过这些实验，我们确认了该检测方法的可行性，并期望该方法能够准确识别月球螺的存在，即使在视觉上难以察觉的情况下。这一成果不仅有助于控制月球螺的扩散，还可能为减少其对 Manila 蛤的捕食压力提供科学依据。通过开发这一检测方法，我们希望能够在不破坏生态环境的前提下，更高效地监测和控制月球螺的分布。

本研究的采样点涵盖了日本列岛和中国，总共包括 11 个地点（图 2）。在日本，采样点主要集中在东北部地区，包括奥姆ori 湖（OC）、宫城县的 Mangoku-ura 湾（MG）、福岛县的 Matsukawa-ura 湾（MT）等。此外，还涵盖了东京湾附近的地点，如东京的 Kasai Rinkai 公园（KS）、千叶县的 Sanbanze（SB）、Ushigome（UG）、Obitsugawa 河口（OB）和 Egawa（EG）、Futtsu（FT）等。这些地点的选择旨在覆盖月球螺可能的分布范围，并评估其在不同环境中的存在情况。通过在这些地点收集样本，我们希望进一步验证 sedDNA 分析的可行性，并为后续的监测和控制工作提供数据支持。

在系统发育分析方面，我们使用了 79 个样本的 COI 基因序列，总长度为 559 个碱基对，包括月球螺和外群。这些序列的拼接结果如图 4 所示。月球螺与外群明显分开，并形成了一个独立的分支。在此次分析中，*N. gualtieriana* 被确认为与月球螺亲缘关系最近的物种。然而，月球螺的群体并未因采样地点而表现出明显的结构差异，这表明其分布可能受到人为因素的影响，而不仅仅是自然扩散。此外，月球螺的遗传多样性较高，这可能与其广泛的分布和适应性有关。这些发现为设计特异性引物和探针提供了重要依据，并有助于进一步理解月球螺的生态适应性及其与 Manila 蛤之间的生态关系。

通过本研究，我们不仅成功开发了一种针对月球螺的 sedDNA 检测方法，还设计了能够识别所有 14 个单倍型的特异性引物和探针。此外，我们还在理想条件下的水族箱环境中验证了该方法的检测能力。实验结果显示，月球螺的 sedDNA 在水族箱环境中可以被高效检测，最高浓度约为 10^8 复制数/克沉积物，主要来源于其爬行痕迹。由于月球螺在爬行过程中会留下黏液，这些黏液可能是 sedDNA 的主要来源。这些实验结果表明，sedDNA 分析可以作为一种有效的工具，用于检测月球螺的存在，即使在视觉上难以察觉的情况下。此外，我们还发现，月球螺的分布可能受到人为因素的影响，而不仅仅是自然扩散。因此，开发一种基于 sedDNA 的检测方法，不仅有助于准确掌握月球螺的分布范围，还可能为减少其对 Manila 蛤的捕食压力提供科学依据。

本研究的结果对于未来的研究和管理具有重要意义。首先，通过开发一种基于 sedDNA 的检测方法，我们能够更准确地评估月球螺的分布情况，这对于制定有效的清除措施至关重要。其次，该方法的建立可以为其他类似物种的监测提供参考，特别是在那些难以直接观察的环境中。此外，本研究还强调了环境 DNA 技术在生态监测和生物多样性研究中的应用潜力，尤其是在评估入侵物种的分布和影响方面。通过这种方法，可以避免对生态环境的破坏，同时提高检测的准确性和效率。此外，本研究还发现，月球螺的分布可能受到人为因素的影响，这表明在控制其扩散时，除了生物防治手段外，还需要考虑人为干预的作用。

在研究过程中，我们得到了多个机构和研究人员的支持。特别感谢宫城县渔业合作社协会的 Ishinomaki 湾分部和福岛县的 Matsukawa-ura 分部，他们在野外调查中提供了重要的支持，并协助运输样本。此外，我们还要感谢 Toyo 食品技术研究所的 Dr. Tomoyasu Yamazaki 和中国海洋大学的 Prof. Jing-Yu Li，在野外采样过程中给予了宝贵的帮助。这些支持对于本研究的顺利进行起到了关键作用。此外，我们还得到了其他相关机构的资助，本研究由 Toyo 食品技术研究所提供资金支持。这一资助对于实验材料的采购、数据分析和结果的验证起到了重要作用。

总的来说，本研究通过开发一种基于 sedDNA 的检测方法，为准确评估月球螺的分布情况提供了新的手段。该方法不仅能够有效识别月球螺的存在，还可能为减少其对 Manila 蛤的捕食压力提供科学依据。通过这一方法，我们期望能够更全面地了解月球螺的生态影响，并为制定有效的清除措施提供支持。此外，本研究还强调了环境 DNA 技术在生态监测中的应用潜力，特别是在评估入侵物种的分布和影响方面。随着环境 DNA 技术的不断发展，我们相信未来将有更多研究利用这一技术，为生态管理和生物多样性保护提供新的工具和方法。