利用扁平固着微滴技术实现单克隆性保障的贴壁与悬浮细胞克隆培养

这篇研究创新性地提出了一种基于扁平固着微滴（sessile microdrops）的单细胞克隆技术，通过优化液滴接触角（contact angle）和光学成像条件，解决了传统微孔板边缘暗区导致的单细胞确认难题。该方法在人类胚胎肾细胞（HEK）、癌症细胞、诱导多能干细胞（iPSC）和中国仓鼠悬浮细胞（CHO-S）中实现了62%-78%的高效克隆，并验证了基因编辑工作流的无缝整合，为单细胞分析、药物筛选和细胞系开发提供了非概率性、可视化的单克隆性保障方案。

　　

1 引言

单细胞分离是基因分析和药物筛选等生物医学研究的关键步骤，但传统有限稀释法依赖泊松统计，无法确认微孔中是否仅含单个细胞。微孔边缘的光学折射效应（dark optical edge effects）会遮蔽细胞观察，而微流控等技术存在操作复杂、兼容性差等问题。本研究提出将细胞置于微孔中央的固着微滴中，通过降低接触角消除液滴边缘的暗区，实现单细胞的直接可视化确认。

2 结果

2.1 问题与解决方案

微孔边缘的折射效应（图1A）可通过中央沉积微滴（1 μL）规避，但高接触角液滴仍存在边缘暗区（图1B）。通过接触线钉扎（contact-line pinning）移除90%体积后，液滴变平（θ≈7.3°），光学清晰度显著提升（图1D）。

2.2 理论：接触线钉扎与液滴光学

液滴体积（V）与接触角（θ）、半径（a）的关系遵循球冠几何模型（图2Bi）。当接触角低于临界值（φ_max = sin^-1(NA/n)），显微镜可捕获全视野光线（图2Biii）。实验验证了PBS+0.5 mg/mL BSA的钉扎稳定性（图S2）。

2.3 工作流程

自动化三轴平台依次完成微滴沉积、体积移除、细胞注入（50 nL含~1.4个细胞）和成像（图3）。确认单细胞后，快速注入培养基（200 μL）以启动克隆生长。

2.4-2.5 液滴性质优化

筛选发现白蛋白（BSA）可替代胎牛血清（FBS）实现稳定钉扎。扁平液滴（θ≈11°）使单细胞清晰可见（图4C），适用于贴壁（iPSC）和悬浮（CHO-S）细胞。

2.6 克隆效率

LNCaP（21天）和CHO-S（14天）形成典型克隆（图5A）。iPSC在层粘连蛋白（laminin）涂层上保持多能性标记（SSEA-4/OCT-4，图6C），且87% HEK克隆位于孔板中心（图6B），优于传统方法的31%。

2.7 基因编辑整合

在CRISPR敲除MYBPC3基因的iPSC中，75%编辑效率的细胞经微滴验证后，46/61单细胞形成克隆（75%效率），测序证实11/12克隆携带编辑（图6D）。

3 讨论

该技术通过物理优化液滴参数，解决了单细胞确认的统计学不确定性，且兼容现有微孔板流程。局限性包括泊松分布导致的细胞分布不均，但可通过重复注样修正。

4 材料与方法

实验使用HEK 293、LNCaP、CHO-S和KOLF2-C1 iPSC，培养基含10% FBS或化学替代物。液滴通过三轴平台（iotaSciences）操控，成像采用Olympus IX53显微镜。CRISPR编辑通过Neon核转染系统完成，测序使用ICE工具分析。

（注：全文细节均源自原文实验数据，未添加主观推断。）