基于高通量树脂吸头模块的AAV纯化工艺开发加速策略

本文推荐：该研究创新性地采用高通量（HTP）树脂吸头模块构建端到端AAV纯化平台，通过25 μL微体积树脂结合HTP分析工具（如Stunner、质谱光散射MP），实现全/空衣壳分离参数（如结合容量、缓冲液组成）的高效筛选，仅需2%样本量即可预测制备级纯化趋势，显著加速基因治疗载体开发进程。

　　

摘要

重组腺相关病毒（AAV）作为基因治疗递送载体面临早期材料稀缺、开发周期短等挑战。研究提出集成化高通量（HTP）工作流，以25 μL树脂吸头为核心模块，结合Stunner（2 μL样本/2分钟检测）和质谱光散射（MP）等HTP分析工具，实现结合动力学（Langmuir模型拟合k_ads=2.25×10^-17 mL/cp·s）、树脂筛选（POROS 50HQ vs HyperCel AX）等关键参数的高效优化。

材料与方法

树脂吸头操作：40秒/循环的吸排操作中，35次循环可使AAV6在Capto AVB树脂达到结合平衡（2.5×10¹⁴ cp/mL_resin）。结合动力学：AAV9在CaptureSelect树脂20分钟达平衡，最大吸附容量Q_max=1.9×10¹⁵ cp/mL_resin。分析技术：MP定量全/空衣壳比例（5 μL样本/60秒），HPLC-SEC检测高分子量物质（HMW）。

结果

全衣壳富集：通过25 mM BTP缓冲液（pH 8.5）实现空衣壳流穿，AAV9全衣壳比例从13%提升至70%（树脂吸头）vs 60%（1 mL柱）。部分衣壳去除：胆碱氯化物梯度洗脱（5 mM/CV）显示182 mM洗脱缓冲液可去除60%部分衣壳（原22%降至5%）。质量评估：8个Ambr 250培养样本经树脂吸头纯化后，全衣壳比例与Robocolumn相当（CV=6%），但样本量仅需后者2%（5.6 mL vs 135 mL）。

讨论

该工作流突破传统限制：

1. 通量优势：96孔板并行处理vs Robocolumn 8通道；
2. 灵敏度：0.3 mS/cm电导率差异可区分洗脱效果；
3. 成本效益：结合HTP分析工具使开发周期缩短50%。

结论

树脂吸头模块为AAV下游工艺开发提供革命性工具，尤其适用于早期克隆筛选（如96孔板培养）和临床前研究，推动基因治疗载体快速进入临床试验阶段。