敲除甘油代谢途径实现分枝杆菌高效利用甘油作为共溶剂转化植物甾醇

为解决分枝杆菌在植物甾醇转化过程中对高浓度植物油或羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)的依赖问题，中国科学院上海高等研究院等团队通过基因敲除技术构建了甘油代谢缺陷型菌株HGMS6△adhc/△glpk。研究发现该突变体在含10%甘油和0.5% HP-β-CD的发酵培养基中可实现83.8%的植物甾醇转化率，与植物油体系相当。该成果为工业菌株代谢改造提供了新策略，发表于《Applied Microbiology and Biotechnology》。

　　

在甾体药物工业生产中，植物甾醇的生物转化一直面临关键瓶颈——这类疏水性底物需要依赖大量植物油（15-25% w/v）或昂贵的羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)作为分散剂。这不仅增加成本，更导致后续产物分离纯化困难。更棘手的是，传统分枝杆菌在代谢植物甾醇时会产生多种副产物（如ADD和9OH-AD），且甘油作为常见碳源会被菌体优先利用，反而抑制目标产物的积累。

针对这些行业痛点，新疆师范大学生命科学学院联合湖北工业大学等机构的研究团队在《Applied Microbiology and Biotechnology》发表创新成果。他们以工业菌株Mycolicibacterium neoaurum HGMS6（已敲除kstd和kshA/B基因的4-AD高产菌）为研究对象，通过生物信息学分析首次揭示该菌存在两条独立的甘油代谢途径：分别由甘油脱氢酶(ADHC)和甘油激酶(GLPK)启动。通过体外酶学实验证实，GLPK的催化效率是ADHC的7.5倍（比活性3.28 U/mg vs 0.51 U/mg）。

研究人员采用基因敲除技术构建了双突变体HGMS6△adhc/△glpk，该菌株在含葡萄糖培养基中生长正常，但在甘油培养基中完全丧失生长能力。关键突破在于发现：当以10%甘油+0.5% HP-β-CD作为共溶剂时，突变体可实现83.8%（mol/mol）的植物甾醇转化率，与15%植物油体系（77.2%）相当。qPCR分析显示，阻断甘油代谢能显著上调hsd4A1等甾醇侧链降解基因的表达。

主要技术方法包括：1）基于KEGG数据库的代谢通路预测；2）RoseTTAFold蛋白结构预测；3）ADHC和GLPK的异源表达与酶学表征；4）p2NIL-SacB系统的基因敲除；5）5L规模发酵验证。

研究结果揭示：

1. 甘油代谢途径预测：通过KEGG mapper鉴定出9个甘油代谢相关酶，其中ADHC和GLPK分别启动两条独立通路。ADHC途径将甘油逐步转化为丙酮酸，GLPK途径则生成磷酸二羟丙酮进入糖代谢。

2. 酶学特性：纯化的ADHC最适pH 9.0、温度37°C，Km值2.92×10^-4 mol/L；GLPK最适pH 9.0、温度50°C，Km值9.24×10^-5 mol/L，显示GLPK对甘油亲和力更高。

3. 突变体表型：双敲除突变体在甘油培养基中生长完全抑制，但在葡萄糖培养基中与野生型无差异，证实两条途径是分枝杆菌甘油代谢的唯一通道。

4. 发酵优化：小试表明5%甘油+0.5% HP-β-CD组合效果最佳；放大试验显示10%甘油可使转化率达83.8%，且细胞密度不受影响。

该研究首次系统解析了分枝杆菌甘油代谢网络，并通过精确的代谢改造实现三个突破：1）用廉价甘油替代60%植物油用量；2）将HP-β-CD浓度从常规2%降至0.5%；3）避免甘油代谢产物对甾醇转化的抑制。这不仅降低生产成本超40%，更简化了下游分离工艺，为甾体药物绿色制造提供了创新解决方案。未来可通过动态调控策略进一步优化甘油/植物甾醇共代谢，推动工业菌株的迭代升级。