氮限制诱导红酵母蛋白质氧化与磷酸化重编程调控碳流分配和脂质重塑的分子机制

本研究针对产油酵母在氮限制条件下脂质积累的调控机制这一关键科学问题，通过整合脂质组学、氧化蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学技术，系统解析了Rhodotorula toruloides在氮充足与饥饿条件下的代谢调控网络。研究发现脂质积累主要受AMPK/TOR信号通路调控的碳流重分配和自噬过程驱动，首次揭示了脂肪酸合成酶(FAS1)等关键脂质合成酶的氧化修饰动态。该研究为理解微生物脂质合成的PTM调控机制提供了多维数据，为AI/ML驱动的蛋白质结构建模和代谢工程策略开发奠定了基础。

　　

在生物能源和生物制造领域，产油酵母因其卓越的脂质生产能力备受关注。然而，传统通过氮饥饿诱导脂质积累的方法存在明显局限性——虽然能提高脂质产量，却会导致细胞抗氧化系统失衡，影响整体生产效率。更关键的是，人们对这种胁迫条件下蛋白质翻译后修饰(PTM)如何调控代谢流分配的认识仍存在巨大空白。

太平洋西北国家实验室(Pacific Northwest National Laboratory)的研究团队在《Biotechnology for Biofuels and Bioproducts》发表的研究中，创新性地采用半自动化多PTM蛋白质组学技术，结合脂质组学分析，揭示了Rhodotorula toruloides响应氮限制的分子机制。研究通过比较碳氮比5:1(高氮)和90:1(低氮)条件下酵母细胞的动态变化，发现脂质积累并非源于代谢酶表达量变化，而是由蛋白质氧化和磷酸化介导的碳流重编程所驱动。

关键技术包括：(1)同步定量蛋白质丰度、半胱氨酸硫醇氧化和磷酸化的多重TMT标记技术；(2)自动化磁珠(SP3)样品制备流程；(3)树脂辅助捕获(RAC)富集氧化半胱氨酸肽段；(4)固定金属亲和色谱(IMAC)磷酸化肽段富集；(5)高分辨率Orbitrap质谱分析。

生长和脂质生产动力学

研究发现低氮条件下24小时即出现脂质积累差异，72小时时脂质含量达27.5%，显著高于高氮条件的10%。值得注意的是，两种条件下生物量(CDW)和葡萄糖消耗速率相似，表明碳流向脂质合成的重编程是氮限制的主要效应。

脂质组学分析揭示氮可用性驱动的脂质谱重塑

共鉴定206种脂质物种，其中鞘脂类和心磷脂在低氮条件下显著下调，而甘油三酯(TG)和辅酶Q₉(CoQ₉)上调。正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)显示心磷脂、磷脂酰乙醇胺(PE)和TG是区分氮条件的关键脂类。脂质物种富集分析(LSEA)进一步证实多不饱和脂肪酸在低氮条件下富集，提示去饱和酶活性增强可能与氧化应激响应相关。

氮限制引发蛋白质硫醇氧化和磷酸化的系统性转变

研究定量了2,804个蛋白质、5,926个半胱氨酸位点和17,195个磷酸化位点。主成分分析(PCA)显示氮条件对PTM状态的影响大于培养时间。低氮条件下平均硫醇氧化率增加20-35%，尤其脂肪酸合成酶(FAS1)的C825/C1106等关键位点氧化状态显著改变。

氮代谢与自噬的PTM水平调控

谷氨酸脱氢酶(GDH2)T24/S26磷酸化上调，谷氨酰胺合成酶(GLN1)C251氧化状态降低，表明氮同化途径的PTM调控。自噬相关蛋白27(ATG27)C27/C188氧化水平升高，与线粒体自噬标志物DNM1下调共同提示细胞器更新在脂质积累中的作用。

碳流向脂合成的PTM调控

三羧酸循环酶表达下调，而丙酮酸羧化酶(PYC1)表达上调。ATP-柠檬酸裂解酶(ACL1)S706/S512-T513磷酸化变化可能影响乙酰-CoA供应。乙酰-CoA羧化酶(ACC1)S1159去磷酸化与哺乳动物AMPK调控模式一致，其C1315氧化状态改变提示氧化还原调控节点。

信号通路的PTM调控网络

TORC1复合物中TOR1C275氧化增强，SCH9S750磷酸化上调，与营养感知相关。钙信号通路中钙调蛋白(CMD1)表达上调，SNF1(AMPK)T345/T347磷酸化增强，调控脂解酶TGL4。MAPK通路中HOG1Y173磷酸化与鞘脂代谢变化相关，共同构成应激响应网络。

这项研究首次系统揭示了产油酵母中PTM介导的脂质积累调控机制：1)脂质积累主要源于自噬过程提供的碳骨架和氮限制导致的碳流重分配，而非代谢酶表达量变化；2)AMPK/TOR/钙信号通路通过PTM调控协调应激响应与脂质合成；3)脂肪酸合成酶等关键酶的氧化修饰动态为理解氧化还原调控提供了新视角。该多维数据集不仅为AI/ML预测PTM功能奠定了基础，更为开发不依赖氮限制的脂质生产策略提供了理论依据，对生物燃料和生物基化学品生产具有重要指导意义。