3D生物打印脂肪干细胞小细胞外囊泡负载的可注射HAMA-CPC水凝胶促进骨修复的机制研究

本研究针对骨缺损修复的临床挑战，创新性地将3D生物打印技术制备的高产量脂肪干细胞小细胞外囊泡（3D-sEVs）与可注射HAMA-CPC水凝胶结合，开发出HAMA-CPC@3D-sEVs复合支架。通过体外实验证实该材料显著促进骨髓基质细胞（BMSCs）增殖迁移和成骨分化，并增强人脐静脉内皮细胞（HUVECs）血管生成能力。大鼠胫骨缺损模型显示其能提高骨体积分数（BV/TV）和小梁厚度（Tb.Th），蛋白质组学揭示NAMPT-S1PR1-VEGF通路是关键作用机制。该研究为骨组织工程提供了兼具高效性和安全性的新型治疗策略。

　　

骨缺损修复一直是骨科领域的重大挑战。传统治疗方法如自体骨移植存在供区并发症，异体移植可能引发免疫排斥，而合成材料则面临整合困难等问题。随着再生医学的发展，间充质干细胞（MSCs）及其分泌的小细胞外囊泡（sEVs）展现出巨大潜力，但常规二维培养的sEVs产量低且功能有限。更关键的是，sEVs体内应用面临快速清除的难题，亟需开发既能维持sEVs活性又能实现缓释的载体系统。

中山大学附属第三医院的研究团队在《Journal of Nanobiotechnology》发表创新成果，通过同轴3D生物打印技术构建高密度脂肪干细胞（ADSCs）微纤维，获得高产量的3D培养sEVs（3D-sEVs），并将其负载于透明质酸甲基丙烯酸酯（HAMA）与钙磷酸盐水泥（CPC）复合水凝胶中。研究采用的主要技术包括：同轴3D生物打印制备细胞微纤维、差速超离心提取sEVs、流变学表征水凝胶性能、大鼠胫骨缺损模型评估修复效果，以及蛋白质组学分析作用机制。

3D-sEVs的鉴定与特性

通过透射电镜观察到3D-sEVs呈现典型杯状形态，纳米颗粒追踪分析显示其粒径分布均匀（100-200 nm）。Western blot检测到CD63、CD81等sEVs标志蛋白，且3D培养使sEVs产量提高近千倍。激光共聚焦显示PKH67标记的3D-sEVs能被BMSCs和HUVECs有效内化。

复合水凝胶的理化特性

HAMA-10CPC水凝胶在405 nm光照15秒即可固化，扫描电镜显示其表面形成针状CPC晶体。流变学测试表明该材料具有最佳粘弹性（G'=1200 Pa），体外释放实验证实其能持续释放sEVs达16天。

促骨再生效应

在成骨诱导培养基中，HAMA-CPC@3D-sEVs组BMSCs的碱性磷酸酶活性提高2.3倍，茜素红染色显示钙结节面积增加158%。qPCR检测到COL-1、OCN等成骨基因表达显著上调。大鼠实验中，微CT显示4周时实验组骨体积分数（BV/TV）达38.7%，显著高于对照组。

促血管生成机制

蛋白质组学发现3D-sEVs富含烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT），其通过上调HUVECs中S1PR1受体，激活VEGF信号通路。当使用NAMPT抑制剂FK866后，sEVs促血管生成效应被显著抑制。

该研究创新性地将3D生物打印技术与复合水凝胶系统结合，首次阐明NAMPT-S1PR1-VEGF轴在sEVs介导的骨再生中的作用。HAMA-CPC@3D-sEVs不仅解决sEVs体内半衰期短的问题，还通过协同成骨-血管化耦合效应加速缺损修复。这种"材料-细胞-因子"三位一体的策略，为临床大段骨缺损治疗提供了新思路。研究揭示的3D培养sEVs分子机制，也为其他组织再生研究提供了范式参考。