仿生磷树状大分子多表位纳米疫苗增强对非洲猪瘟病毒的体液和细胞免疫应答

本研究针对非洲猪瘟病毒(ASFV)疫苗研发难题，创新性地构建了靶向树突状细胞(DC)的仿生纳米疫苗PPH-Nb-rAg@PM。通过筛选pXCR1特异性纳米抗体(Nb)与ASFV关键抗原表位融合表达，并负载于磷树状大分子(PPH)后包被病毒激活的巨噬细胞膜，该疫苗在小鼠模型中显著增强中和抗体水平和CD4+/CD8+T细胞应答，单细胞测序证实其可促进记忆B细胞和浆细胞分化。这项发表于《Journal of Nanobiotechnology》的研究为ASFV亚单位疫苗开发提供了新策略。

　　

非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的烈性传染病，自2018年传入中国以来已造成巨大经济损失。这种具有复杂包膜结构的DNA病毒能编码150多种蛋白，但现有疫苗研发面临重大挑战：灭活疫苗保护效果有限，减毒疫苗存在安全隐患，而基于p30、p54等单一蛋白的亚单位疫苗难以诱导全面免疫应答。更棘手的是，ASFV能通过多种机制逃逸宿主免疫系统，这使得同时激活体液和细胞免疫成为疫苗设计的核心难题。

河南农业大学的研究团队创新性地将仿生纳米技术与多表位疫苗策略相结合，开发出靶向树突状细胞的仿生纳米疫苗PPH-Nb-rAg@PM。这项发表于《Journal of Nanobiotechnology》的研究通过整合ASFV五个关键蛋白(p30、p54、p72、pB602L和CD2V)的B/T细胞表位，结合特异性纳米抗体和磷树状大分子载体，最终在动物模型中实现了协同激活体液和细胞免疫应答的目标，为ASFV疫苗研发提供了新思路。

研究团队采用多项关键技术：1)通过噬菌体展示筛选靶向猪XCR1受体(pXCR1)的高亲和力纳米抗体；2)从ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞(PAM)提取预激活膜(PM)；3)利用第三代磷树状大分子(PPH)构建核壳结构纳米颗粒；4)采用单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析免疫细胞亚群变化；5)通过ELISpot和流式细胞术评估细胞免疫应答。

在"筛选和鉴定ASFV优势B和T细胞表位"部分，研究人员从五个ASFV蛋白中鉴定出41个B细胞表位和11个T细胞表位。通过点-ELISA和ELISpot验证，最终筛选出p30-B1/B6、p72-B10/B13等10个优势B细胞表位，以及p30-T2、CD2V-T2等3个优势T细胞表位。分子模拟显示这些表位在II型ASFV毒株中高度保守且位于蛋白表面。

"制备pXCR1特异性Nb和Nb-rAg重组蛋白"部分详细描述了纳米抗体的开发过程。通过免疫双峰骆驼获得效价达1:256,000的抗血清，经四轮噬菌体淘选获得三种特异性纳米抗体，其中Nb21对pXCR1的亲和力最高。共聚焦显微镜证实Nb21能特异性识别DC2.4细胞表面的XCR1受体。将Nb21与多表位抗原(rAg)通过柔性连接子串联表达，获得77 kDa的Nb-rAg融合蛋白。

在"PPH-Nb-rAg@PM NPs的制备和表征"章节，研究显示当PPH与Nb-rAg质量比为3:1时，包封效率达76.79%。动态光散射显示纳米颗粒粒径为169.0±5.6 nm，zeta电位-26.2 mV。透射电镜证实成功构建了核壳结构，SDS-PAGE和Western blot验证了TLR2/4/6在PM上的高表达。稳定性实验表明PPH-Nb-rAg@PM在生理环境中能保持15天不聚集。

"体外细胞毒性和细胞摄取实验"结果表明，即使浓度达240 μg/ml，PPH-Nb-rAg@PM对RAW264.7和DC2.4细胞仍无显著毒性。荧光成像显示巨噬细胞对PPH-Nb-rAg@PM的摄取比裸露PPH-Nb-rAg减少4.8倍，但DC2.4细胞的摄取增加1.17倍，证实膜包被既能延长循环时间又不影响DC靶向性。体内分布实验显示Cy5.5标记的PPH-Nb-rAg@PM在肺、脾和淋巴结中富集，48小时后仍保持强荧光信号。

关于"PPH-Nb-rAg@PM NPs促进NK细胞增殖"的发现尤为突出。体外实验显示PPH能协同IL-2促进NK细胞(CD3^-CD49⁺)增殖至26.41%，并刺激IFN-γ和穿孔素分泌增加2.8倍。小鼠免疫实验证实PPH-Nb-rAg@PM组的脾脏NK细胞比例较PBS组提高1.48倍，血清IFN-γ水平显著升高，表明PPH具有固有免疫调节活性。

在"PPH-Nb-rAg@PM NP免疫诱导体液免疫应答"方面，二次免疫后49天，该疫苗诱导的IgG滴度是传统rAg组的55.2倍。抗体亚型分析显示IgG1/IgG2a比值>1，提示Th2型免疫偏倚。更重要的是，免疫血清在1:8稀释时仍能显著抑制ASFV p30蛋白表达，中和抗体效价是rAg组的4倍。

研究还发现"PPH-Nb-rAg@PM NP免疫诱导系统性细胞免疫应答"。流式分析显示该疫苗使脾脏CD4⁺和CD8⁺T细胞比例分别增加1.52和1.94倍。ELISpot检测发现IFN-γ和IL-4分泌细胞数显著增加，淋巴细胞增殖指数提高3.2倍。这些结果证实该疫苗能协同激活Th1和Th2型免疫应答。

单细胞转录组分析揭示了"PPH-Nb-rAg@PM疫苗通过增强免疫细胞激活诱导保护性免疫"的机制。UMAP聚类显示免疫组脾脏中T_NK细胞、B细胞和浆细胞数量显著增加，而中性粒细胞减少。进一步分析发现记忆B细胞(MS4A1⁺)和浆细胞(Jchain⁺)群体扩增，CD4⁺和CD8⁺T细胞亚群比例协调上升，细胞互作网络增强。

这项研究创新性地将DC靶向策略、多表位设计、磷树状大分子载体和仿生膜技术相结合，解决了ASFV疫苗研发中免疫原性不足的瓶颈问题。PPH-Nb-rAg@PM不仅能延长抗原递呈时间，还能通过TLR通路激活天然免疫，协同诱导高水平中和抗体和记忆T细胞应答。该平台技术也为其他重大动物疫病疫苗研发提供了重要参考，具有广阔的转化应用前景。