工程化毕赤酵母高效生产高价值甾体药物中间体15α-OH-D-乙基孕二酮的突破性研究

本研究针对甾体药物关键中间体15α-OH-D-乙基孕二酮(15α-OH-DE)化学合成效率低、副产物毒性大等问题，通过代谢工程改造毕赤酵母(Pichia pastoris)，共表达丝状真菌Penicillium raistrickii来源的甾体15α-羟化酶基因PRH和面包酵母NADPH再生关键酶ZWF1基因，建立高效生物转化体系。在5L生物反应器中实现15α-OH-DE产量5.79 g/L（底物投料10 g/L），创目前报道最高水平，为甾体药物绿色制造提供新策略。

　　

在甾体药物王国中，15α-OH-D-乙基孕二酮(15α-OH-DE)被誉为"避孕药皇冠上的明珠"——作为最强效孕激素gestodene的关键前体，它的合成效率直接决定着现代口服避孕药的生产成本。然而，传统化学合成法长期受困于三大魔咒：底物水溶性差、细胞毒性强、羟化效率低，导致生产工艺始终难以突破瓶颈。面对这一挑战，浙江工业大学生物工程学院的研究团队将目光投向了微生物细胞工厂，在《Microbial Cell Factories》发表的研究中，他们通过精巧的代谢工程策略，让毕赤酵母这个"微生物工作狂"焕发出惊人的合成潜力。

研究团队采用多基因共表达技术，将甾体羟化酶PRH与NADPH再生引擎ZWF1植入毕赤酵母GS115宿主，通过启动子优化、高密度发酵等系统改造，建立完整的甲醇诱导表达体系。关键技术包括：① 多拷贝整合表达载体构建；② DO-stat控制的补料分批发酵；③ 表面活性剂辅助底物溶解；④ RT-qPCR监控基因表达；⑤ HPLC定量分析产物。

【工程化毕赤酵母菌株构建】

通过SnaBI/EcoRI双酶切将PRH基因克隆至pPIC3.5K载体，SalI线性化后电转GS115，获得高拷贝整合菌株15134。进一步引入S. cerevisiae来源的ZWF1基因构建强化NADPH再生的Z15134工程菌，RT-qPCR证实关键基因表达量显著提升（PRH表达量达β-actin的3.2倍）。

【发酵参数优化】

在摇瓶规模系统优化中发现：0.06%(v/v)Tween 80使底物转化率从76.78%提升至99.1%；初始pH5.0时15α-OH-DE产量达1.45 g/L；2.0%(v/v)甲醇补充最佳，过高浓度(3.0%)会抑制生长。DO调控实验显示20%装液量(50mL/250mL瓶)最利于氧传递。

【5L生物反应器放大】

采用三阶段高密度培养策略：① 甘油批式阶段(19.5h)→② 甘油补料(5h)→③ 甲醇诱导(170h)。通过DO-stat动态调控甲醇-底物混合补料(12.5 g/L DE)，最终在196 h发酵中获得5.79 g/L 15α-OH-DE，底物转化率92.3%，细胞密度OD₆₀₀达329.2，较原始菌株P. raistrickii生产效率提升9.3倍。

这项研究实现了三大突破：首次在毕赤酵母中重构甾体15α-羟化途径；创下15α-OH-DE微生物合成的最高产量纪录；建立甲醇利用型细胞工厂生产高值甾体的通用平台。特别值得注意的是，通过强化PPP途径的限速酶G6PDH（由ZWF1编码），使NADPH供应与羟化反应需求精确匹配，解决了电子传递瓶颈。该成果不仅为gestodene等甾体药物的工业化生产提供更经济、环保的替代工艺，其"羟化酶+辅因子"双表达策略更为其他高值氧化产物的微生物合成提供了范式转移。正如研究者Bin Xue团队强调的，这种将真核表达系统与代谢网络设计相结合的方法，有望成为复杂天然产物合成的"万能钥匙"。