基于胶原结合特性的牛乳细胞外囊泡亚群分离及其在骨质疏松性骨缺损修复中的功能研究

本研究针对骨质疏松性骨缺损修复的临床挑战，通过分离牛乳细胞外囊泡（mEVs）中具有胶原结合特性的功能亚群（cb+mEVs），发现其通过富集膜联蛋白V（AnxV）显著促进间充质干细胞的成骨分化（钙沉积增加1.2倍）及大鼠股骨缺损再生（骨量提升2.4倍），为功能性EV亚群的精准筛选及骨再生治疗提供了新策略。

　　

骨质疏松性骨缺损的修复一直是临床难题，传统自体骨移植存在供区并发症，而异体骨又缺乏成骨活性。近年来，细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）因其天然的信使功能和低免疫原性成为再生医学的新星，但EVs的高度异质性导致其功能难以标准化。牛乳来源的EVs（mEVs）因来源广泛、稳定性强备受关注，然而如何从中筛选出具有明确骨修复功能的亚群仍是未解之谜。

为解决这一问题，深圳大学（Shenzhen University）的研究团队创新性地利用胶原结合特性分离功能性mEVs亚群，相关成果发表于《Materials Today Bio》。研究人员通过超速离心结合尺寸排阻色谱（SEC）纯化mEVs，利用胶原结合实验筛选出仅占总量4%的^cb+mEVs亚群，结合蛋白质组学、免疫磁珠分选和3D水凝胶递送系统，系统评估了其在体外成骨分化、离体人骨器官培养及骨质疏松大鼠骨缺损模型中的修复效能。

关键技术包括：1）基于胶原结合实验分离EV亚群；2）质谱分析鉴定AnxV富集；3）CD9⁺AnxV⁺mEVs的免疫磁珠分选；4）3D胶原水凝胶构建及体内外释放动力学检测；5）骨质疏松大鼠股骨髁缺损模型的微CT（μCT）与组织学分析。

3.1 mEVs的分离与表征
通过冷冻电镜（Cryo-EM）和纳米颗粒追踪分析（NTA）证实mEVs为直径<200 nm的脂质双层囊泡，表达HSP-70、Alix等标志蛋白，且CD9⁺亚群占比较高，为后续功能研究奠定基础。

3.2 mEVs促进成骨效应
在成骨诱导培养基中，mEVs使人间充质干细胞（hBMSCs）的I型胶原表达提升，碱性磷酸酶（ALP）活性和钙沉积显著增加；人骨器官模型中，局部注射mEVs的钻孔区域荧光标记显示矿化增强。

3.3 胶原结合亚群的功能优势
仅4%的mEVs能结合胶原，但该亚群（^cb+mEVs）被hBMSCs高效内吞（>60%），并驱动1.2倍钙沉积，而非结合亚群（^cb-mEVs）无此效应。

3.4 AnxV的关键作用
蛋白质组学揭示^cb+mEVs富集AnxV，其与CD9共定位。免疫磁珠去除AnxV⁺mEVs后，剩余EVs（^AnxV-mEVs）的细胞摄取和成骨活性显著降低，证实AnxV介导胶原结合及功能传递。

3.5 3D水凝胶递送验证
mEVs在胶原水凝胶中呈现缓释特性（6天内释放68%），负载^cb+mEVs的水凝胶使hBMSCs矿化程度最高，而^AnxV-mEVs组与对照组无差异。

3.6 体内骨再生疗效
在卵巢切除（OVX）骨质疏松大鼠模型中，^cb+mEVs水凝胶使骨缺损区新生骨量提升2.4倍（μCT），组织学显示胶原纤维排列更致密；而去除该亚群后疗效消失。

这项研究首次阐明胶原结合能力可作为EV功能亚群的筛选标准，并锁定AnxV为关键效应蛋白。其意义在于：1）提出“EV固有特征（EV-inherent feature）”新概念，为异质性研究提供范式；2）开发基于天然相互作用的EV亚群分离技术，避免人工修饰的潜在风险；3）为骨质疏松等难愈性骨缺损提供现成的（off-the-shelf）治疗策略。未来通过扩大AnxV⁺mEVs的富集规模，或可推动其临床转化。