快速简便的侧向层析检测技术：ADH1B/ALDH2基因分型PCR-限制性酶切-接头连接-侧向层析(PRALL)方法的开发与应用

研究人员针对酒精代谢关键基因ADH1B(rs1229984)和ALDH2(rs671)单核苷酸多态性(SNP)检测存在的操作复杂、设备依赖性强等问题，开发了一种名为PRALL的新型快速基因分型方法。该方法整合多重PCR、BslI限制性酶切、等位基因特异性接头连接和侧向层析检测(LFA)技术，可在1小时内完成从口腔拭子粗提DNA到可视化结果的全流程，检测灵敏度达15个等位基因拷贝，与Sanger测序结果100%一致。这项研究为酒精代谢相关疾病的个性化风险评估提供了简便可靠的POCT解决方案。

　　

酒精代谢过程中的个体差异一直是临床医学和公共卫生领域关注的重点。酒精在人体内的代谢主要依赖两条关键通路：酒精脱氢酶(ADH)将乙醇转化为有毒的乙醛，随后乙醛脱氢酶(ALDH)将其氧化为无害的乙酸。其中，ADH1B和ALDH2基因的单核苷酸多态性(SNP)会显著影响酶活性——ADH1B*2等位基因编码高活性变异体加速乙醇代谢，而ALDH2 * 2等位基因则编码无功能亚基导致乙醛蓄积。这些遗传变异不仅造成饮酒后面部潮红等反应，更与食管癌等酒精相关疾病风险密切相关，在东亚人群中尤为常见。然而，现有SNP检测技术如Sanger测序、实时荧光PCR等或操作繁琐，或依赖昂贵设备，难以满足基层医疗和现场检测需求。

日本福冈大学(Fukuoka University)的研究人员Naoto Shirasu和Shin'ichiro Yasunaga在《Talanta》发表研究，开发了一种名为PRALL的创新检测方法。该方法巧妙整合了四步关键技术：口腔拭子粗提DNA制备、生物素标记引物的双重PCR扩增、BslI限制性酶切与等位基因特异性接头连接的单管反应(REAL)，以及无需仪器的侧向层析检测(LFA)。研究人员使用25例人类基因组DNA样本验证显示，该方法可在1小时内完成检测，灵敏度达100pg DNA(约15个等位基因拷贝)，与Sanger测序结果完全一致。

【原理设计】研究团队设计的PRALL检测核心在于BslI酶切产生的等位基因特异性粘性末端。PCR扩增时，生物素标记引物引入BslI识别位点，酶切后形成含SNP位点的4碱基突出端。通过精心设计的半抗原标记接头，仅与正确等位基因的突出端特异性连接，最终经LFA实现可视化判读。

【方法优化】针对临床样本特点，研究优化了粗提DNA处理方法，证实10分钟95°C加热即可满足后续检测需求。双重PCR体系采用MightyAmp DNA聚合酶，确保ADH1B和ALDH2基因同步高效扩增。REAL反应创新性地将酶切与连接合并为单管步骤，显著缩短操作时间。

【性能验证】使用梯度稀释的人类基因组DNA测试显示，PRALL对ADH1B和ALDH2 SNP的检测限分别为156pg和125pg。在25例临床样本验证中，所有结果均与Sanger测序一致，且不同操作者间重复性达100%。LFA条带显色强度与DNA量呈正比，便于半定量分析。

这项研究的突破性在于首次将限制性酶切的特异性与LFA的简便性完美结合。相比传统方法，PRALL具有三大优势：一是全过程仅需1小时，较常规PCR-RFLP缩短40分钟；二是通过酶切-连接双重保障，特异性显著高于单纯等位基因特异性PCR；三是LFA读值无需专业设备，适合基层应用。研究人员特别指出，该方法对口腔拭子粗提样本的良好兼容性，使其在酒精中毒急诊筛查、社区健康普查等场景具有独特价值。

该技术的成功开发为遗传性酒精代谢异常筛查提供了新工具，其模块化设计思路也可拓展至其他SNP检测领域。正如作者强调，这种将分子生物学操作简化为"样本进-结果出"模式的尝试，为推进精准医疗的普惠化提供了重要技术参考。未来研究可进一步优化冻干试剂制备，使该技术真正实现"口袋实验室"的愿景。