基于基因编码APLNR构象生物传感器的Apelin梯度体内测量技术突破

本研究针对Apelin受体(APLNR)在心血管发育和肿瘤血管生成中的关键作用，开发了基于FRET、BRET和cpGFP的构象生物传感器工具箱。研究人员通过药理学表征和信号转导分析验证了APLNR-cpGFP生物传感器的优越性能，并在斑马鱼胚胎中成功实现了内源性Aplnr活性的可视化，首次在体内测量到跨细胞距离的Apelin配体梯度。该研究为解析Apelin信号通路的时空活动提供了强大工具，对相关疾病治疗策略开发具有重要意义。

　　

在生命科学领域，G蛋白偶联受体(GPCRs)作为最大的膜蛋白受体家族之一，在多种生理和病理过程中扮演关键角色。其中，Apelin受体(APLNR)作为A类GPCR，已被证实参与心血管发育、肿瘤血管生成、糖尿病和肥胖等多种重要生理病理过程。然而，长期以来科学家们面临一个重大挑战：如何在活体生物中实时监测APLNR的时空活动？这一问题的解决对于理解Apelin信号通路的调控机制以及开发相关疾病治疗策略至关重要。

Philipps-University Marburg的研究团队在《Nature Communications》发表了一项突破性研究。他们开发了一套基于基因编码的APLNR构象生物传感器工具箱，包括基于荧光共振能量转移(FRET)、生物发光共振能量转移(BRET)和圆排列绿色荧光蛋白(cpGFP)的多种传感器。通过系统的药理学验证和功能分析，研究人员成功实现了APLNR活性的实时监测，并在斑马鱼模型中首次观测到Apelin配体梯度的体内分布。这项研究为解析Apelin信号通路的时空动态提供了革命性工具。

研究采用了多项关键技术：1) 开发了基于FRET、BRET和cpGFP的多种APLNR构象生物传感器；2) 通过药理学方法验证传感器对Apelin和Apela的响应特性；3) 在HEK293细胞中评估传感器的信号转导能力；4) 利用转基因斑马鱼模型进行体内验证；5) 采用显微注射和热休克诱导系统实现配体的时空特异性表达。

比较不同APLNR构象生物传感器设计

研究人员设计了12种APLNR构象生物传感器变体，包括4种FRET、4种BRET和4种cpGFP传感器。通过单细胞显微镜和96孔板实验发现，所有FRET构建体在Apelin刺激下显示出约10%的FRET降低，而BRET变体则无明显变化。值得注意的是，插入F233和K235位点的两种APLNR-cpGFP变体表现出最高的信噪比，为后续研究奠定了基础。

APLNR-cpGFP生物传感器的药理学验证和APLNR配体表征

对APLNR(F233)-cpGFP和APLNR(K235)-cpGFP生物传感器进行详细药理学分析发现，Apelin和Apela表现出不同的效力和效能。Apela作为部分激动剂，其EC₅₀值(7-8 nM)显著低于Apelin(182-186 nM)，但最大反应较弱。竞争实验证实小分子拮抗剂ML-221能够以3-5 μM的K_i值阻断Apelin诱导的荧光反应。

评估APLNR-cpGFP生物传感器的信号传导能力

虽然两种APLNR-cpGFP生物传感器在细胞膜表达水平与野生型APLNR相当，但其G_i1蛋白激活和Arrestin3招募效率有所降低。活细胞荧光成像显示，野生型APLNR转染的HEK293细胞在Apelin刺激后出现明显的Arrestin3-mCherry膜转位，而APLNR-cpGFP转染细胞仅显示微弱反应，表明cpGFP模块的插入影响了受体与下游效应器的偶联效率。

APLNR-cpGFP生物传感器在体内的功能性验证

在斑马鱼胚胎中，研究人员通过热休克诱导系统实现Apelin和Apela的泛表达，成功激活APLNR(K235)-cpGFP生物传感器，荧光强度增加27%。通过构建稳定转基因品系，发现ISV(节间血管)内皮细胞中的生物传感器信号比DA(背主动脉)和PCV(后主静脉)高50%，证实了Apelin信号在ISV形成中的重要作用。基因敲除和过表达实验进一步验证了生物传感器监测内源性Aplnr活性的能力。

测量体内Apelin配体梯度

通过显微注射技术将apln mRNA与Dextran-AF647示踪剂共注射到斑马鱼胚胎特定卵裂球中，研究人员首次在活体中测量到Apelin浓度梯度。距离Apelin分泌细胞1-3个细胞距离内的受体激活水平保持稳定，而在4-5个细胞距离处分别下降16%和23%，为理解形态发生素梯度调控提供了直接证据。

开发比率型APLNR-cpGFP-mScarlet-I3生物传感器

为提高体内应用的可靠性，研究人员开发了四种比率型生物传感器变体，将mScarlet-I3直接或通过p2A自剪切肽与APLNR-cpGFP融合。体外验证表明这些变体均能可靠检测受体激活，且不受FRET效应影响。斑马鱼血管特异性表达实验证实，p2A变体在ISV中显示出70%的信号增强，优于非p2A变体的35%。

这项研究开发的APLNR构象生物传感器不仅解决了活体监测GPCR活性的技术难题，更为理解Apelin信号在发育和疾病中的时空调控提供了全新视角。特别是能够在单细胞分辨率下测量配体梯度的能力，为研究形态发生素梯度调控机制开辟了新途径。这些传感器工具的应用将加速APLNR靶向药物的发现和优化，对心血管疾病、肿瘤和代谢性疾病的治疗策略开发具有重要价值。