关键核苷酸位点调控Cas12a crRNA活性的通用光控CRISPR诊断技术

为解决CRISPR诊断中一锅法检测的模板干扰难题，研究人员通过系统分析Cas12a crRNA重复识别序列(RRS)的关键位点，发现第3、4位点突变会显著影响酶活性，进而开发出基于第4位点NPOM光笼修饰的通用光控策略。该技术结合crRNA拆分设计，实现了可预制试剂、适配任意靶基因的高灵敏度检测，为POCT诊断提供了新方案。

　　

在分子诊断领域，CRISPR-Cas系统因其高特异性被称为"基因剪刀"，但实现核酸扩增与CRISPR检测的一锅法反应始终面临关键瓶颈——Cas酶会过早切割扩增模板。现有光控策略需针对不同靶序列反复优化crRNA修饰位点，存在成本高、通用性差等问题。来自广州医科大学附属第一医院的研究团队在《Nature Communications》发表突破性成果，通过揭示Cas12a crRNA中四个核苷酸的重复识别序列(RRS)对酶活性的调控机制，开发出仅需单碱基修饰的通用光控技术。

研究采用crRNA突变筛选、分子信标分析、凝胶电泳验证等技术，结合临床样本队列验证（35例肺炎支原体咽拭子）。关键发现包括：1）RRS区域第4位尿苷(U⁺⁴)突变使Cas12a活性丧失>90%；2）NPOM光笼修饰该位点可实现完全抑制和365 nm光照激活；3）将crRNA拆分为通用光笼片段(10 nt)和靶标特异性片段(26 nt)，检测限达1 aM（10^-18 M）。

关键核苷酸位点筛选

通过系统突变RRS的四个位点发现，第3/4位点突变几乎完全消除crRNA介导的trans-cleavage（荧光报告系统）和cis-cleavage（凝胶电泳）。分子信标实验证实突变体仍能结合靶DNA，说明活性丧失源于酶构象变化而非靶标识别障碍。

单碱基光控策略开发

对比RRS-3和RRS-4位点的NPOM-dT修饰，发现RRS-4修饰的crRNA在光照后活性恢复率达100%，优于三处间隔区修饰的crRNA（需针对不同靶序列重新设计）。

拆分crRNA设计

将crRNA在茎环区拆分为10 nt+26 nt片段，保留全长crRNA效率的同时，使光笼修饰片段可预制。该设计在检测SARS-CoV-2、EBV等五种病原体时均实现1 aM灵敏度。

临床验证

便携式检测设备配合Chelex-100快速样本处理（2分钟），对肺炎支原体临床样本的检测结果与qPCR完全一致（Ct值35.06仍可检出），全程耗时<20分钟。

这项研究通过揭示Cas12a活性的关键调控位点，建立了"一处修饰适配万种靶标"的通用光控体系。其创新性体现在：1）将crRNA设计复杂度从O(n)降至O(1)；2）拆分设计使试剂成本降低80%；3）为CRISPR诊断的标准化生产奠定基础。该技术已成功应用于呼吸道病原体检测，未来可拓展至基因编辑的时空控制领域。