Rad52与Rad55-Rad57协同调控Rad51丝状体形成的分子机制揭示同源重组新机制

本研究针对同源重组(HR)修复过程中Rad51在Rpa包裹的ssDNA上成核和延伸的分子机制这一关键科学问题，通过单分子光学镊子和荧光标记技术，首次可视化Rad52介导的Rad51丝状体形成过程。研究发现Rad52通过其无序C端将多分散的Rad51分选为单体，并在ssDNA-dsDNA连接处优先加载；Rad55-Rad57复合物可显著增强Rad51结合效率约60%。研究提出的"分选-堆叠-延伸"(SSE)模型为理解真核生物HR修复机制提供了重要理论框架，对癌症等基因组不稳定相关疾病治疗具有重要指导意义。

　　

DNA双链断裂(DSBs)是细胞中最危险的DNA损伤类型，可导致染色体畸变和缺失，是大多数癌症的典型特征之一。在真核生物中，同源重组(HR)是修复DSBs的关键途径，其核心步骤是Rad51重组酶在单链DNA(ssDNA)上形成核蛋白丝状体。然而这一过程面临重大挑战：ssDNA结合蛋白Rpa对DNA的亲和力(KD<1 nM)远高于Rad51(KD~1 μM)，需要中介蛋白协助完成置换。虽然已知酵母Rad52和人类BRCA2是功能类似物，但Rad51丝状体组装的分子机制仍不清楚。

美国圣路易斯大学医学院的研究人员通过创新性的单分子技术，在《Nature Communications》发表了突破性研究成果。他们首次实现了Rad51丝状体形成的实时可视化观察，揭示了Rad52和Rad55-Rad57协同调控Rad51动态组装的分子机制。研究采用sfGFP标记的Rad51(Rad51^GFP)和单分子光学镊子技术，结合交联质谱(XL-MS)和生物化学分析，系统阐明了Rad52通过其C端无序区域分选Rad51，并在ssDNA-dsDNA连接处优先加载的关键过程。

关键技术方法包括：1) 工程化具有活性的荧光标记Rad51^GFP和Rad51^Cy5；2) 单分子光学镊子结合荧光成像实时追踪Rad51结合事件；3) 交联质谱解析Rad52-Rad51相互作用界面；4) 分析超速离心和质谱光度法表征蛋白质复合物；5) D-loop和ATP酶活性测定验证蛋白质功能。

研究结果主要包括：

S. cerevisiae Rad51在溶液中呈多分散状态

通过质谱光度法和分析超速离心发现，Rad51在溶液中存在从单体到十聚体的广泛分布，其中二聚体占主导。交联质谱显示Rad51分子间存在大量交联位点，证实其自发形成寡聚体的倾向。

Rad52的C端将Rad51分选为单体

交联质谱分析发现Rad52通过两种作用模式与Rad51互作：模式1(Mode-1)由Rad52无序C端介导，能消除Rad51分子间交联；而缺失C端的Rad52^ΔC则丧失这一功能。质谱光度法证实仅含C端片段(Rad52^ΔN*)即可将Rad51分选为单体。

直接观察Rad51在ssDNA上的结合

创新性地使用N端插入sfGFP的Rad51^GFP，首次实现Rad51结合事件的直接可视化。光学镊子实验显示Rad51^GFP的ssDNA结合严格依赖ATP，而Rad52可显著促进这一过程。

Rad52优先在ssDNA-dsDNA连接处堆叠Rad51

在Rpa包裹的缺口DNA上，Rad52-Rad51复合物优先定位于5'凹陷连接处。光子计数分析显示连接处结合的Rad51信号更强，表明存在更高阶复合物。缺失C端的Rad52^ΔC完全丧失这一定位能力。

Rad55-Rad57促进Rad51丝状体延伸

加入Rad51旁系同源物Rad55-Rad57后，Rad51结合量增加约60%，丝状体长度延长约0.1μm。这表明旁系同源物在丝状体延伸中起关键作用，但不同于中介蛋白的初始加载功能。

研究结论提出了"分选-堆叠-延伸"(SSE)模型：Rad52首先通过C端(Mode-1)将多分散的Rad51分选为单体，再通过N端环状结构(Mode-2)将其堆叠在特定位置；这一复合物优先定位于ssDNA-dsDNA连接处，在Rad55-Rad57协助下完成丝状体延伸。该发现不仅阐明了酵母HR修复的分子机制，也为理解人类BRCA2-RAD51系统提供了重要参考。尽管Rad52与BRCA2结构迥异，但它们通过相似的SSE机制调控重组酶功能，暗示这一机制在进化上的保守性。研究建立的可视化技术平台为后续研究DNA修复蛋白动态组装提供了重要工具，对开发靶向HR通路的新型抗癌药物具有指导意义。