长读长测序技术革新癌症基因融合检测：靶向与全转录组联合策略的开发与应用

本研究针对传统短读长测序在癌症基因融合(GF)检测中存在的局限性，创新性地将靶向panel与全转录组长读长测序技术相结合。美国宾夕法尼亚大学团队通过优化牛津纳米孔(ONT)长读长测序平台，成功在临床癌症样本中检测到包括ETV6::NTRK3等已知融合，并在原panel阴性胶质瘤样本中发现20个新型融合。该研究建立的计算分析流程显著提高了融合检测灵敏度，将传统14-21天的检测周期缩短至1-2天，为癌症精准诊断提供了新范式。

　　

在癌症基因组学领域，基因融合(Gene Fusion, GF)作为关键的驱动事件，既是重要的诊断标志物，也是治疗靶点。从慢性髓系白血病中著名的BCR::ABL融合到非小细胞肺癌中的EML4::ALK融合，这些染色体易位产生的嵌合基因不断刷新着人们对肿瘤发生机制的认知。然而，传统短读长测序技术(~150bp)受限于读长和比对算法，难以准确识别复杂结构变异，特别是在重复序列或低复杂度区域。临床常用的靶向panel如CHOP Cancer Fusion Panel虽能检测119个癌基因相关融合，但存在周期长(14-21天)、无法发现新型融合等局限。

美国宾夕法尼亚大学(University of Pennsylvania)和费城儿童医院(CHOP)的研究团队在《Cell Reports Methods》发表了一项突破性研究。他们创新性地将靶向panel与全转录组长读长测序技术结合，建立了快速、全面的GF检测新体系。研究采用牛津纳米孔技术(Oxford Nanopore Technologies, ONT)平台，通过Flongle和PromethION两种流动槽对54个临床样本(包括27个panel阳性和24个panel阴性胶质瘤样本)进行测序，开发了整合LongGF、JAFFAL和FusionSeeker的分析流程。

关键技术包括：1) 将短读长panel文库适配至ONT平台；2) 使用MinKNOW进行实时碱基识别；3) 建立多层级过滤标准(涉及读段支持数、基因相关性、链特异性等)；4) 通过PCR和Sanger测序验证新型融合。特别针对胶质瘤样本，研究人员还排除了GTEx数据库中正常脑组织常见的融合事件。

主要研究结果通过四个层次呈现：

Combining panel-based and whole-transcriptome-based gene fusion detection by long-read sequencing
研究团队首先验证了ONT平台对已知融合的检测能力。在27个panel阳性样本中，Flongle流动槽成功检出21个样本的预期融合(如EBF1::PDGFRB、GNAI2::BRAF等)，PromethION则提升至19个样本。值得注意的是，在Flongle漏检的6个样本中，PromethION成功找回3例(如HIP1::MET融合)，显示测序深度对检测灵敏度的影响。通过IGV可视化验证，典型融合如ETV6::NTRK3的断点位置与临床报告完全一致。

Cohort 1: Long-read GF detection by Flongle flow cell
针对Flongle未检出的样本，深入分析揭示了技术限制：IGH::CRLF2融合因断点位于基因间区被算法过滤；EGFR exon21-23跳跃属于基因内重排而非基因间融合；STIL::TAL1则因两基因相邻(~80kb)，剪接感知比对未能正确分割读段。这些发现为算法优化提供了明确方向。

Cohort 2: Long-read whole-transcriptome GF detection by PromethION flow cell
在24个panel阴性胶质瘤样本中，全转录组测序发现180个独特融合，其中20个经实验验证为潜在新型融合(如ATG4B::CNTRL)。高级别胶质瘤(HGG)的融合数量显著多于低级别(LGG)，符合其基因组不稳定性特征。数据库比对发现4个已知融合的变体形式，如MDM2::RAP1B在胶质母细胞瘤中的新断点。

Identification of potentially novel GFs
通过严格过滤标准(排除线粒体基因、HLA基因等)和GTEx正常组织背景过滤，最终确认的20个新型融合中，部分基因如OLIG2、CHTOP与中枢神经系统疾病相关，暗示其潜在临床意义。凝胶电泳和Sanger测序验证了这些融合的真实性，尽管ATG4B::CNTRL因SINE重复元件在阴性对照中出现非特异性扩增。

这项研究的意义体现在三个方面：方法学上，首次实现临床级靶向panel与全转录组长读长测序的整合应用；临床上，将融合检测周期从2-3周缩短至1-2天，且PromethION流动槽每个样本成本仅$40-100；科学上，在panel阴性样本中发现20个新型融合，为胶质瘤分子分型提供新线索。研究建立的生物信息学流程(已开源)包含独特的多层级过滤策略，特别是引入健康组织背景过滤，显著提高结果可靠性。

局限性在于部分样本仍使用短读长文库，未能充分发挥ONT长读长优势；未来需扩大样本量验证新型融合的临床相关性。随着纳米孔技术错误率降至1%(v14化学试剂+R10流动槽)，该方法有望成为融合检测的新标准。该成果不仅为癌症基因组学研究提供新工具，更展现了长读长测序在临床诊断中的应用前景，推动个性化医疗发展。